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高速冷凍離心機(jī)在分離細(xì)胞核基質(zhì)中的應(yīng)用
核基質(zhì)是指真核細(xì)胞間核中除核被膜、染色體和核仁以外的一個精密網(wǎng)架系統(tǒng)，既包含蛋白質(zhì)，又包含RNA。核基質(zhì)是從純化的細(xì)胞核中分離的。要用去污劑、核酸酸處理細(xì)胞核。以分離核基質(zhì)的每一步中抑制核酸酶的活性非常重要。
本文介紹1986年Comerford使用過的分離細(xì)胞核基質(zhì)的方法和步驟。
1. 大鼠肝臟(50~100g)剪碎，加3倍體積的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)。勻漿后通過幾層紗布過濾，在4℃，勻漿液以800gmax(用的是MSE Chilspin離心機(jī)，4*100ml轉(zhuǎn)子，2100r/min)離心10分鐘。把沉淀重新懸浮在勻漿緩沖液里，該緩沖液包含56%(質(zhì)量濃度)蔗糖，再在4℃以60000gmax(用Sorvall OTD50超速離心機(jī)，A641轉(zhuǎn)子，28000r/min)離心90分鐘。把沉淀用20mL勻漿緩沖液洗兩次。
2. 把細(xì)胞核沉淀重新懸浮在20mL STEM緩沖液中[STEM：50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EGTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)]，加入四硫酸鈉，終濃度為0.2mmol/L。在4℃孵育后，加入N-乙酰馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide，NEM)，終濃度為5mmol/L。
3. 在800 gmax離心沉淀細(xì)胞核，并用20mL STEM洗三次，把細(xì)胞核重新懸浮在20ml STEM中，補(bǔ)加20μg/mL DNase I(Boehringer, grade I)，在37℃孵育20分鐘，再在800 gmax離心回收沉淀。
4. 把沉淀懸浮在20mL LS緩沖液里[LS緩沖液：10mmol/L Tris-HCl，0.2mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)] ,在4℃孵育10分鐘, 再在800 gmax離心10分鐘回收沉淀。
5. 把沉淀重新懸浮在1mL 含有70%(質(zhì)量濃度)蔗糖的LS緩沖液里。上面鋪放3層蔗糖梯度，各2ml 60%，50%和40%(質(zhì)量濃度)蔗糖(用含2mol/L NaCl的LS緩沖液配制蔗糖溶液)。在800 gmax離心1小時，細(xì)胞核基質(zhì)在40%和50%蔗糖分離界面。回收后用STEM緩沖液(10ml)洗一次。
該方法可用于各種類型細(xì)胞核基質(zhì)的分離。
本文介紹1986年Comerford使用過的分離細(xì)胞核基質(zhì)的方法和步驟。
1. 大鼠肝臟(50~100g)剪碎，加3倍體積的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)。勻漿后通過幾層紗布過濾，在4℃，勻漿液以800gmax(用的是MSE Chilspin離心機(jī)，4*100ml轉(zhuǎn)子，2100r/min)離心10分鐘。把沉淀重新懸浮在勻漿緩沖液里，該緩沖液包含56%(質(zhì)量濃度)蔗糖，再在4℃以60000gmax(用Sorvall OTD50超速離心機(jī)，A641轉(zhuǎn)子，28000r/min)離心90分鐘。把沉淀用20mL勻漿緩沖液洗兩次。
2. 把細(xì)胞核沉淀重新懸浮在20mL STEM緩沖液中[STEM：50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EGTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)]，加入四硫酸鈉，終濃度為0.2mmol/L。在4℃孵育后，加入N-乙酰馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide，NEM)，終濃度為5mmol/L。
3. 在800 gmax離心沉淀細(xì)胞核，并用20mL STEM洗三次，把細(xì)胞核重新懸浮在20ml STEM中，補(bǔ)加20μg/mL DNase I(Boehringer, grade I)，在37℃孵育20分鐘，再在800 gmax離心回收沉淀。
4. 把沉淀懸浮在20mL LS緩沖液里[LS緩沖液：10mmol/L Tris-HCl，0.2mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)] ,在4℃孵育10分鐘, 再在800 gmax離心10分鐘回收沉淀。
5. 把沉淀重新懸浮在1mL 含有70%(質(zhì)量濃度)蔗糖的LS緩沖液里。上面鋪放3層蔗糖梯度，各2ml 60%，50%和40%(質(zhì)量濃度)蔗糖(用含2mol/L NaCl的LS緩沖液配制蔗糖溶液)。在800 gmax離心1小時，細(xì)胞核基質(zhì)在40%和50%蔗糖分離界面。回收后用STEM緩沖液(10ml)洗一次。
該方法可用于各種類型細(xì)胞核基質(zhì)的分離。