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上海申知心生物科技有限公司
主營產品： 高血脂癥動物模型,心血管疾病動物模型,缺血性心臟病動物模型 |
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2017-9-28 閱讀(6888)
每當拿到一個質粒圖譜，是不是一下就有點懵了？這些ori、RBS、tet是什么？這些箭頭代表什么，轉錄的方向嗎？不要著急，申知心生物把這些告訴你，也許會解決你的困惑。
質粒和載體傻傻分不清楚
質粒(Plasmid)是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區DNA原有的能夠自主復制的較小的DNA分子(即細胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的質粒雖然都是環狀構型。
載體即要把一個有用的基因（目的基因——研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。細菌或病毒質粒是重組DNA技術中常用的載體。
簡而言之，質粒可以說是一個統稱，載體是質粒改造過用來運載的工具
選用質粒做載體的要求
以常用的為例
（1）選分子量小的質粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多（也有大載體）；
（2）一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般 10 個以上的拷貝，而嚴謹型質粒<10 個。
（3）必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；
（4）必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr。
無論選用哪種載體，先都要獲得載體分子，然后采用適當的限制酶將載體 DNA 進行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進行連接。
如何一眼看穿質粒圖譜
① 復制起始位點Ori，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒），Ori的箭頭指復制方向，其他元件標注的箭頭多指轉錄方向（正向）。
② 再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記：
Ampr：水解β-內酰胺環，解除氨芐的毒性。
tetr ：可以阻止四環素進入細胞。
camr：生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。
neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。
hygr：使潮霉素β失活。
③ 看多克隆位點（MCS）：它具有多個限制內切酶的單一切點（質粒上只能有該內切酶的*酶切序列，不然就一刀好幾段了），便于咱們要研究的基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選，常見的是β-半乳糖苷酶的藍白斑篩選系統。
④再看外源DNA插入片段大小：質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA的片段。一般來說，外源DNA的片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。
⑤ 是否含有表達系統元件，即啟動子（promoter）－核糖體結合位點（RBS）－轉錄終止信號（AATAAA同時是poly A）。這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。
⑥看報告基因：主要是為了能迅速檢查功能基因是否表達的陽性判斷，表達成功的蛋白在小鼠體內分布位置。
⑦看質粒圖譜上的箭頭：它代表DNA兩條鏈（正義鏈和反義鏈），即質粒是環狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。
目的基因片段進行連接。
