多種細胞的培養方法

HePG2細胞和L-02細胞的傳代：
HePG2細胞屬人肝腫瘤的恒生細胞株，L-02細胞則是人胎肝細胞株，二者所使用的培養基可以是一樣的，即zui常見的DMEM。一干使用低糖的。
細胞長滿培養瓶時既要傳代。使用胰酶消化即可。用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。使用前37度預熱，細胞經PBS清洗兩遍后，每個中號培養瓶加0.7ml的胰酶，胰酶的量可根據自己培養瓶的大小而定，原則就是能夠蓋滿瓶底。加入胰酶以后，為使酶的活性zui大，將培養瓶蓋擰緊后放回培養箱中，3分鐘左右即用含血清的培養基終止消化。如果在室溫情況下消化，時間相應加長，可以在顯微鏡下觀察，當細胞界限已十分清楚，即已分離為單個細胞，且有少量細胞漂起，則要終止消化了。
16HBE細胞株的傳代方法：
鏡下觀察細胞生長融合達70-80%，準備傳代。常規開紫外照射超凈臺20分鐘，同時把含10%胎牛血清的MEM培養基、0。25%胰酶、PBS放置37度培養箱中孵育。20分鐘后開始傳代。先棄掉舊培養液，加PBS洗一次，然后加0。25%胰酶2ml消化（指25乘25cm大小的培養瓶）細胞，鏡下觀察細胞，細胞突起回縮，細胞變圓，然后將培養瓶放置37度二氧化碳培養箱中孵育3分鐘左右（當然時間是隨機的，比如：新配的胰酶作用時間短一些，配制時間長的胰酶作用時間會長一些，當然要不斷地鏡下觀察），待細胞大部分消化下來（大部分細胞呈流沙狀脫離瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培養基終止消化。反復吹打瓶壁上殘留的細胞，并將已消化下來的細胞吹打均勻，然后吸入離心管中1000轉離心1分鐘，然后棄掉上清，用手指將離心管中的細胞彈打均勻，加新培養基，吹打均勻，分至3個新的培養瓶中，補足培養液。將培養瓶平放，小心移入37度二氧化碳培養箱中培養過夜。次日觀察。

胃癌細胞AGS和SGC-7901的培養：細胞傳代時不能長的太滿,70%-80%就可以傳了.實驗前先把紫外燈打開照30分鐘,然后再把鼓風機開10分鐘,同時把培養液和胰酶放入37度水浴箱中,千萬記住不要蓋上水浴箱的蓋子.傳代時,我一般把培養瓶口過一下火,就直接把培養液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等細胞變圓,細胞間空隙加大就直接把培養液到去,不用離心,然后再吹打,雖說要輕柔,但很難吹打成單細胞懸液,所以稍用力也沒有關系.雖然操作不規范,但節省時間,細胞也沒有被污染.

AAV-293細胞的傳代:
AAV-293細胞較喜歡成團生長,比較嬌嫩,怕冷,傳代時不要一次從二氧化碳培養箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出來傳就可以了,否則細胞很容易死掉.細胞在50-60%傳代,細胞生長狀態.
用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶消化半分鐘左右,棄去胰酶.觀察培養瓶是否有針孔樣縫隙,如有就可以加入培養液吹打細胞.消化過久,對細胞損害很大,而且成團很難吹打成單個細胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.輕輕放入二氧化碳培養箱中培養.



肺癌細胞（人類），其中絕大部分都是貼壁細胞，具體如：
（１）?。粒担矗梗ǚ蜗侔?br />（２）　ＮＣＩＨ４４６（小肺細胞癌）
（３）　８０１（非小肺細胞癌）
（４）　ＮＣＩＨ４６０?。ù蠹毎伟?br />
在消化傳代過程中，步驟基本一致：
吸去舊的培養液－＞用Ｈａｎｋｓ'（１Ｘ）清洗一兩次－＞加入一定量的消化液（Ｔｒｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）－＞置顯微鏡下觀察，待細胞大部分變圓時，回到超靜臺－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培養液－＞反復吹打細胞－＞再置顯微鏡下觀察，直到細胞全部懸浮起來－＞吸出一部分加入新的培養瓶中－＞zui后再補充加入一定量新的培養液（ＲＰＭＩ１６４０ｗｉｔｈ　１０％　ＦＢＳ）．
注意：　吹細胞時盡量多吹邊角兒，此處細胞生長的多．另外吸出細胞前要混勻．
另注：消化液的配制方法：
Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Na
prepared with 2.5g Trpsin(1:250) and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS
小鼠前脂肪細胞（3T3-L1）：
吸棄原培養液-->PBS洗一兩次-->加入400ul0.125％胰酶（原代加0.05% EDTA）消化-->轉動培養盤，保證整個盤面都被trypsin液潤過->吸棄trypsin后37度消化3min-->以*培液（DMEM+10% FCS＋1/1000Biotin+1/1000泛酸鈣-->吸打（槍的吸力調至zui?。?：10接種，前后左右搖晃培養盤，細胞均勻后放入培養箱繼續培養（10%CO2 ,37度）

MDBK（牛腎細胞）類型：貼壁細胞
來源：購自武漢病毒所細胞保存中心
由四川農業大學動物生物技術中心繁殖保存
傳代步驟：
棄去舊的生長液-->用無鈣鎂水(CMF)沖洗貼壁細胞數次(視細胞瓶的大小,3--5次)-->剩少許CMF,滴入 ATV 2--3滴-->搖勻細胞瓶中的液體,使ATV均勻的分布到瓶里的沒個地方-->放入37度二氧化碳溫箱中3--5min消化-->棄去ATV,加入生長液,拍打吸吹下細胞-->鏡下觀察-->分瓶-->作好記號,放入37度二氧化碳溫箱生長
細胞特點:該細胞生長力強,而且快速一般24h就可以張到80%,48h不傳就會變的很老,所以該細胞傳時要勤點;我感覺MDBK還是很好傳的,比以前我傳的ST、Vero細胞等要好傳一些，且不那么容易死亡，所以是我的一個比較好的選擇！該細胞適合接種皰疹病毒（如：偽狂犬病毒）！

BHK-21：棄除舊的培養液后---用緩沖液沖洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化約兩分鐘左右可以看到細胞像沙子一樣脫落-------趕緊倒掉胰酶加入含10%的牛血清培養液終止消化。但目前國內能找到的BHK-21細胞大部分都有支原體感染，如果是好的BHK-21細胞能做到1比20的分種率。
補充一點關于BHK-21的培養,先用少量胰酶沖洗一下,棄去,再用胰酶消化1min左右,效果會好一些

皮膚成纖維細胞和THP-1細胞：皮膚成纖維細胞是貼壁生長的。THP-1細胞是懸浮的。
由于我們實驗室養細胞的時間也不是很長，所以也只能說說自己平時的操作了。
先說皮膚成纖維細胞。當細胞鋪滿瓶底，也就是細胞與細胞之間沒有間隙時，就可以傳代了。一般十天左右傳一代。先吸棄舊培養液，用D-Hanks液洗兩遍，再加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆蓋瓶底為準。加入后輕輕搖晃培養瓶使液體覆蓋瓶底，然后靜置兩分鐘左右，是能在顯微鏡下觀察，當細胞之間出現間隙且有一部分細胞呈現圓形后即可。吸去胰酶，加入含血清培養液，搖晃瓶子使培養液覆蓋瓶底就行了。因為血清可以終止胰酶的消化。然后吹打瓶底各處使細胞脫落。再分瓶補加培養液。
THP-1細胞的傳代就比較簡單了。可以有兩種傳代方法。如果鏡下觀察細胞狀態很好，沒有其它雜質即細胞裂解物之類的，就可以采用直接傳代法。傳代前將細胞培養瓶直立一個半小時使細胞自然下沉。吸棄上層少量培養液約三分之一，將余下的培養液分成兩瓶，再分別補加培養液即可。如果鏡下觀察覺得培養液中有雜質即可采用離心傳代法。如果細胞數目較多可以低速離心約600轉離心六分鐘，細胞可以沉淀下來而且可以去除細胞碎片之類的雜質。如果覺得細胞數目不多比較寶貴，那就提高轉速可以1000轉離心六分鐘，這樣細胞損失很少但可能也有些雜質會一起沉淀下來。離心后去除上清液，加入新的培養液吹打渾勻即可分瓶傳代了。
目前的方法就這些，希望對新手有所幫助

BHK－21的經驗：
吸出培養基，吸得越干凈越好，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培養箱消化。是否需要用hanks 或 pbs之類得緩沖洗細胞并不必要，我都沒有洗，感覺應該洗一下更好，但也更麻煩并增加了污染得可能性。如果細胞長得太老，可以先加入1ml胰酶在細胞表面浸潤一下就吸出來，然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前預熱到37度。由于胰酶平時保存在4度，反復預熱對胰酶的活性不好，我的經驗是將胰酶進行分裝，盡可能避免胰酶反復冷卻加熱。消化時間的選擇要根據實際情況決定，BHK－21還是比較好消化的，5－15min應該足夠了，消化時間太長對細胞不利。可以在顯微鏡下觀察消化情況，必要時可以拍打培養瓶幫助細胞分散，消化結束后直接加入培養基即可，胰酶會被血親滅活。一般在T－25瓶中留7－8ml培養基培養。在90％單層細胞時，1：4傳代2天后可長滿。如果使用的培養基偏堿先放在CO2培養箱中平衡。細胞生長中注意觀察培養基顏色（加入酚紅作指示劑），如出現偏黃表明細胞代謝產酸較多，此時如細胞未長滿應更換部分或全部培養基以確保細胞狀態不受影響。