如何選擇一個合適的樣本進行NGS檢測？

研究結果顯示，53.0%（396/747）的樣本，存在RAS突變(KRAS或NRAS突變)。在57.1%（431/747）的樣本中發(fā)現(xiàn)了RAS/BRAF/PIK3CA突變(KRAS、NRAS、BRAF或PIK3CA突變)。有84.2%（629/747）的樣本均檢測到了突變(22個檢測基因中的任意突變)。
在所有22個的基因中，zui常見的突變基因是TP53(56.2%)，其次是KRAS(48.6%)、PIK3CA(9.6%)、FXBW7(5.1%)、NRAS(4.7%)、SMAD4(3.7%)和BRAF(3.5%)。
研究者通過對數據的進一步分析，對我們如何選擇合適的CRC樣本進行NGS檢測，給出了如下提示：
1、對樣本中腫瘤細胞含量進行準確評估是至關重要的。
研究者根據腫瘤細胞含量將樣本分為了三組：第1組（27例樣本）腫瘤細胞含量為10%-19%；第2組（192例樣本）腫瘤細胞含量為20%-30%；第3組（528個樣本）腫瘤細胞含量>30%。研究發(fā)現(xiàn)，無論是從RAS、RAS/BRAF/PIK3CA突變，還是所有突變來看，第3組都比第1組的突變率高（p<0.05）。將活檢樣本和手術樣本分組分析后，在前者中仍然得出了以上結論，但在后者中三組樣本的突變檢出率并沒有統(tǒng)計學差異。
以上結果表明，大多數腫瘤細胞含量≥10％的手術樣本都可適用于NGS檢測。但在分析腫瘤細胞含量低的活檢樣本時，應特別注意假陰性的可能，特別是當樣本很小，或伴有壞死、粘液湖、大量淋巴細胞或其它檢測（如免疫組化）已有很多樣本消耗者。
2、CRC的腫瘤細胞存在分子遺傳學（突變）異質性。與RAS突變相比，腫瘤內異質性更易發(fā)生在PIK3CA突變的腫瘤中。
腫瘤的分子遺傳學（突變）異質性對CRC患者的靶向治療是一大挑戰(zhàn)。研究者借鑒了Normanno等報道的異質性評分（heterogeneity score，HS）值來評估腫瘤內突變的異質性。
研究結果顯示，PIK3CA的HS值明顯低于KRAS、NRAS和BRAF。通過對RAS和PIK3CA同時突變的47例樣本的分析發(fā)現(xiàn)，PIK3CA基因的突變豐度要顯著低于相應的RAS基因的突變豐度。
這些數據表明，與RAS突變相比，腫瘤內異質性更可能發(fā)生在PIK3CA突變的腫瘤中。同時也支持RAS突變常發(fā)生在CRC的早期階段，而PIK3CA突變可能發(fā)生在腫瘤進展期的理論。
3、原發(fā)性和轉移性腫瘤的突變狀態(tài)存在高度一致性，當轉移腫瘤無法獲得時，可用原發(fā)腫瘤替代檢測。
研究的747個樣本中，原發(fā)性腫瘤樣本656個，轉移性腫瘤樣本91個，原發(fā)性和轉移性腫瘤之間的突變狀態(tài)并沒有顯示出差異。進一步分析非配對的原發(fā)性和轉移性腫瘤之間的KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA突變的HS值，也沒有觀察到顯著差異。
此外，分析11對原發(fā)灶和轉移灶配對樣本，11例配對樣本中的10例突變狀態(tài)相同。
4、化療可能會影響CRC的突變狀態(tài)。
對未進行化療患者的624例樣本及化療后患者的105樣本的分析發(fā)現(xiàn)，無論是RAS突變、RAS / BRAF / PIK3CA突變，還是含有任意突變的突變檢出率，均是化療前高于化療后。由于化療會殺死腫瘤細胞，降低腫瘤細胞含量而導致假陰性，所以進一步分析了腫瘤細胞比例>20%的樣本，仍然可得出以上結論，提示化療可能會影響CRC的突變狀態(tài)。
對其中一個病例（case470）化療前后的兩個樣本檢測結果的分析顯示，化療后，之前的TP53突變消失，出現(xiàn)了另一個新的TP53突變，其原因可能與取樣差異或化療藥物誘導基因變異有關，具體機制還需進一步研究。
綜上所述，腫瘤細胞含量低、腫瘤異質性以及化療都可能會影響NGS檢測CRC基因變異的準確性，選擇合適的樣本是NGS檢測的關鍵。此外，多區(qū)域、重復活檢或使用循環(huán)腫瘤DNA動態(tài)監(jiān)測可能有助于NGS更加準確的檢測CRC中的突變。