【免疫熒光】技術全解—染色篇

免疫熒光技術既有抗原抗體反應的高度特異性，又能在熒光顯微鏡下清晰地顯示其形態，直觀性強。該方法可用于組織學中抗原或抗體的定位，也可用于體液標本中抗原或抗體的定量檢測。

一：熒光抗體染色

于已固定的標本上滴加經適當稀釋的熒光抗體。置濕盒內，在一定溫度下溫育一定時間，一般可用
25～37℃ 30min，不耐熱抗原的檢測則以4℃過夜為宜。用PBS 充分洗滌干燥。

熒光顯微鏡檢查應在通風良好的暗室內進行。經熒光抗體染色的標本應在染色當天鏡檢，每次鏡下觀察時間以1～ 2h 為宜，時間過長將使高壓汞燈的發光亮度下降，熒光減弱，工作人員觀察過久對眼睛也有不良影響。作油鏡檢查時，必須用無自發熒光的鏡油。

二：影響熒光抗體染色的各種因素

. pH   熒光素在溶劑中基本上處于離子化狀態，因此，溶劑中的氫離子濃度對熒光強度的影響是極大的。每一種熒光素都有自己合適的pH值，它保持熒光素分子與溶劑之間的電離平衡。pH的改變可以引起熒光素熒光光譜的改變，并可造成熒光強度的降低。

. 溫度   一般情況下，環境溫度的升高對熒光染色有明顯的影響。因為，溫度升高可造成溶液粘滯性增加，溶劑和熒光素分子的動力增大，使熒光淬滅的可能性隨之加大，這就使熒光素分子與其他分子之間的相互碰撞幾率增加，因此，影響了熒光素的熒光強度。一般情況下，溫度在20℃時，熒光素即開始表現溫度淬滅作用。隨溫度升高，熒光淬滅作用就越強，可至熒光*淬滅。溫度在20℃以下，熒光素的熒光強度隨溫度的變化改變不明顯，基本上保持恒量。因此，在適當的低溫環境中進行熒光顯微觀察，可得到更好的效果。

. 熒光素的濃度   在溶液濃度較稀時，熒光強度隨熒光素濃度增加而增加。當熒光素濃度增加到一定程度時，熒光強度達到zui大。再繼續增加濃度，熒光素發生的光可能被鄰近的分子吸收，使熒光強度下降。

. 某些細胞固定劑對熒光素有明顯影響   如甲醛固定的細胞比不固定的細胞熒光強度減弱50%左右。雖然醇類固定劑也有輕微的淬滅熒光作用，但其影響較小。

. 非特異性熒光染色   免疫熒光染色除特異性熒光之外，還出現一些與靶抗原-抗體反應無關的熒光，統稱為非特異性熒光。非特異性熒光染色可由于某些抗原的自發熒光及交叉反應等多種因素產生。有些非特異性熒光染色可通過對照進行鑒別與排除，有些則要通過對抗原的純化、抗體的提純、提高熒光抗體結合物的比例等方面尋找原因逐項清除。