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色譜柱使用與選擇
液相色譜柱的使用和選擇
一、硅膠基質(zhì)填料
1、正相色譜正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán)，如（NH2，APS）和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。
由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份zui先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷（Hexane），二氯甲烷（MethyleneChloride）等。
2、反向色譜反向色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團(tuán)的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分zui先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。
常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
二、聚合物填料聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要優(yōu)點是在PH值為1—14均可使用。相對于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。現(xiàn)有的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。
三、其它無機(jī)填料其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì)，一般于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體，由于在HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點是可以在PH高達(dá)12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定限制，所以未能廣泛應(yīng)用。新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH1-14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料是zui近幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行之中。
怎樣選擇填料粒度目前，商品化的色譜填料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3和5um填料進(jìn)行。填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應(yīng)用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是*的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數(shù)或分離能力，但是柱長更短，以縮短分析時間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。