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青島捷世康生物科技有限公司
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單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)1

時間:2017-8-30閱讀:979
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單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroasorbate reductaseMDHAR

 

試劑盒說明書

 

分光光度法 50 /48

 

注意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

 

測定意義:

 

MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA,在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

 

測定原理:

 

MDHAR 催化 NADH 還原 MDHA 生成 AsA  NAD+NADH  340 nm 有特征吸收峰,但是 NAD+沒有。通過測定 340 nm 光吸收下降速率,來計算出 MDHAR 活性。

實驗中所需儀器及設備:

 

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計、1mL 石英比色皿、可調式移液槍和雙蒸水試劑組成和配置:

 

試劑一:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。

 

試劑二:液體 50mL×1 瓶,室溫保存。

 

試劑三:粉劑×1 瓶(棕色),4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。

 

試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。

 

試劑五:液體 25μL×1 瓶,4℃保存。臨用前加 5mL 試劑二充分溶解。

 

粗酶液提取:

 

1. 組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿。8000g4℃離心 10min,取上清置冰上待測。

 

2. . 細菌、真菌:按照細胞數量(104 個):試劑一體積(mL)為 500~10001 的比例(建

 

 500 萬細胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);8000g 4℃離心 20min,取上清液置冰上混勻待測。

 

3. 血清等液體:直接測定。

 

MDHAR 測定操作:

 

1. 分光光度計預熱 30 min,調節(jié)波長到 340 nm,蒸餾水調零。

 

2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min

 

3. 依次在比色皿中加入 100μL 試劑三、100μL 試劑四、100μL 試劑五和 600μL 試劑二,zui后加入 100μL 上清液,迅速混勻后于 340nm 比色,記錄 30s  150s 的吸光值 A1  A2

 

A=A1-A2

 

MDHAR 活性計算公式:

 

(1). 按蛋白濃度計算

 

MDHAR 活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH  1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = A÷ε÷d×V 反總×109Cpr×V 樣)÷T

 

= 804×A ÷Cpr

 

(2). 按樣本質量計算

 

MDHAR 活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH  1U MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = A÷ε÷d×V 反總×109W×V ÷V 樣總)÷T

= 804×A ÷W

 

3)按細胞數量計算

 

MDHAR 活性單位定義:25℃中每 104 個細胞每分鐘氧化 1nmol NADH   1 個酶活單位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V 反總×109÷(細胞數量×V ÷V 樣總)÷T = 804×A ÷ 細胞數量

 

4)按液體體積計算

 

MDHAR 活性單位定義:25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH  1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mL) = A÷ε÷d×V 反總×109÷V 樣)÷T

 

= 804×A

 

εNADH 摩爾消光系數,6220 L/mol/cmd:比色皿光徑,1cmV 反總:反應體系總體積, 1mL=0.001 LV 樣:加入反應體系中上清液體積,100μL=0.1mLCpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質濃度需要另外測定,建議使用本公司蛋白質含量 BCA 試劑盒;V 樣總:加入提取液體積,1mLW,樣本質量,gT:反應時間,2min

 

注意事項:

 

    臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存,3 天內使用完。

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