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青島捷世康生物科技有限公司
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L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶活性測定試劑盒說明書

時間:2016-11-21閱讀:1161
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L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶(L-galacto,4-lactone dehydrogenase

Gal LDH)活性測定試劑盒說明書

分光光度法

50/48

注意:正式測定之前選擇 2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

L-半乳糖途徑是合成 AsA的主要途徑。Gal   LDH位于線粒體內膜,負責催化植物體內 AsA

生物合成的zui后一步,也是該途徑的關鍵酶之一,對植物體內 AsA含量的積累起著至關重

要的作用。

測定原理:

Gal LDH催化 L-半乳糖內酯還原細胞色素 cCyt c),還原型Cyt c在  550nm有吸收峰;測

定還原型 Cyt c增加速率,來計算Gal LDH活性。

自備儀器和用品:

臺式離心機、可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入40mL蒸餾水,充分溶解。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水,充分溶解。

粗酶液提取:

按照組織質量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL

試劑一)進行冰浴勻漿。13000g4℃離心10min,取上清置冰上待測。

Gal LDH測定操作:

1.分光光度計預熱30 min,調節波長到550nm,蒸餾水調零。

2.試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min

3.依次在 1mL玻璃比色皿中加入 100μL上清液、800μL預熱的試劑二和100μL試劑三,迅

速混勻后于 550nm比色,記錄10s130s的吸光值A1A2,△A=A2A1

Gal LDH活性計算公式:

(1).按蛋白濃度計算

Gal LDH活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1μmol Cyt c1個酶活單位。

Gal LDH (μmol/min/mg prot) =A÷ε÷d×V反總×106÷Cpr×V樣)÷T

=289×A ÷Cpr

(2).按樣本質量計算

Gal LDH活性單位定義:25℃中每克樣品每分鐘還原1μmol Cyt c1個酶活單位。

Gal LDH (μmol/min/g鮮重)  =A÷ε÷d×V反總×106÷W×V÷V樣總)÷T

=289×A ÷W

ε:還原型 Cyt c摩爾消光系數,17.3×103L/  mol/cmd:比色皿光徑(cm)1cmV反總:反

應體系總體積,1mL=0.001 L1061mol=1×106μmolV樣:加入反應體系中上清液體積,

100μL=0.1mLCpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質濃度需要另外測定,建議使用本公

司蛋白質含量 BCA試劑盒;V樣總:加入提取液體積,1mLW,樣本質量,gT:反應

時間,2min

注意事項:

試劑二和試劑三配制好后 3天內使用完。

 

 

 

                               

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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