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細胞膜的流動性或微粘度
膜的流動性或者微粘度,可以通過測量結合到膜雙分子層中的疏水熒光探針的熒光偏振來研究。因為熒光分子吸收偏振光的幾率和發射熒光的偏振度與熒光分子相對于激發光偏振面的空間取向有關。
若以線偏振光激發隨機取向的熒光分子,那么,與激發光偏振面取向一致的那些熒光分子具有zui大的吸收。由于多數熒光分子的激發太壽命是幾毫微秒的數量級,已經吸收了偏振光的一部份熒光分子,到它們發射熒光時,已經偏離開它們的原始取向,使得發射出熒光偏振面的方向將發生變化。
若用兩個互相垂直的偏振面測量發射的熒光強度之間的關系,可以估計熒光分子自由轉動的程度。以I1和I2分別代表平行于或者垂直于激發光偏振面的熒光強度。
流式細胞術測量熒光偏振常用的熒光探針為DPH(Di-phenylhexatriene)。DPH是不帶電荷的疏水性物質,在水介質中幾乎沒有熒光,在非極性溶劑中用紫外光激發,(zui大激發波長為351nm),發藍色熒光(zui大發射波長為430nm)。
DPH的標記程序為:將DPH制備成溶解于THF (Tetrahydrofuran,四氫呋喃)濃度為2nM的貯液,保存于4℃暗處。用PBS稀釋貯存液成為2uM的工作液,對于含約2×106細胞的1ml細胞懸液(在PBS中),加入1ml DPH工作液,在37℃下消化30分鐘,離心洗細胞后,重新懸浮在冷PBS中,置于冰上待流式測量。在熒光顯微鏡下觀察DPH結合熒光,可見到細胞內膜和細胞外膜呈現明亮藍色DPH熒光,其熒光強度約為不染色區熒光強度的30倍。
除DPH以外,還有其它一些測量膜流動性或微粘度的熒光探針,例如DiIC18(3),它的激發zui大值為546nm,發射zui大值為565nm。還有DMA-DPH(1-(4-dimethylaminop-henyl)-6-phenylhexatriene)),它的激發zui大值為400nm,發射zui大值為500nm,DMA-DPH除光譜特性比DPH向長波方向移動外,另一個優點是向細胞內部標記比DPH慢些。
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