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DNA 損傷試劑盒(彗星電泳法)說明書

時間:2021/3/23閱讀:1729
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一、產(chǎn)品說明

DNA 在自由基(如·OH)的攻擊下容易發(fā)生損傷,即脫氧戊糖遭到破環(huán),磷酸二脂鍵的斷裂,堿基的破環(huán)或脫落,便可進(jìn)一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂。將細(xì)胞固定于低熔點(diǎn)瓊脂糖中,取少量細(xì)胞涂在載玻片上,用堿高鹽溶液破壞細(xì)胞膜,再用堿溶液使 DNA 分子解旋。將載玻片置于電泳液中,在電場的作用下,DNA 分子向陽極移動。如果 DNA 損傷嚴(yán)重,碎片多,則電泳速度快。未受損傷的 DNA 大分子則由于細(xì)胞膜的阻隔,滯留在原處。用 PI 染色或銀染,可觀察到DNA 受損的細(xì)胞形同彗星現(xiàn)象,作定性分析。也可用相關(guān)的軟件作定量分析。

二、所需儀器及自備試劑

低速離心機(jī)、水平電泳儀、熒光顯微鏡、37℃和 45℃恒溫水浴箱、載玻片、蓋玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microube、0.4mmol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液、PBS

三、注意事項(xiàng)

Propidium Iodide(PI)EB 有毒,操作時要戴手套。

、操作步驟

1、細(xì)胞用冰冷的PBS 洗一次,離心收集,用PBS 重懸使其密度為 1×106 /mL;

2、鋪膠:下述各濃度瓊脂糖凝膠均用 PBS 配制

1 層凝膠的制備:將載玻片的磨砂面向上,45℃預(yù)熱,將預(yù)熱 45℃ 100μL  0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)鋪于載玻片上,蓋上干凈的蓋玻片,再置 4℃ 10min 使NMA 凝固。

2 層凝膠的制備:將 10μL 細(xì)胞(約 104 )和 75μL  0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA(在 37℃下水浴加熱至 20min 使之*溶化)混合均勻。然后,輕輕揭去蓋玻片,迅速將含細(xì)胞的LMA 滴到第 1 層瓊脂糖上, 立即蓋上另一干凈蓋玻片,置 410min 使第 2 層LMA 凝固。

3 層凝膠的制備:第 2 層LMA 凝固后,在室溫下小心移去蓋玻片,滴加預(yù)熱 37℃的 75μL  0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA,如上蓋上蓋玻片 4℃下凝固(第三層覆蓋第二層周圍 0.5mm,增加凝膠化作用時間至 30min, 高濕度環(huán)境)。

3、細(xì)胞裂解

移去蓋玻片,將玻片置于平皿中,倒入預(yù)冷的 Lysis Bufffer(使用前每 9mL 加入 1mL DMSO),4℃ 裂解 1~2h,取出載玻片用PBS 漂洗。

4、DNA 堿解旋

將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液(用戶自備 1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH),約覆過載玻片膠面 0.25cm 左右,室溫放置 20~60min,以便使DNA 在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段,使DNA 斷鏈在電場中易于遷移。

5、單細(xì)胞電泳

在電壓 25V,電泳 20~30min,電壓、電流可用改變緩沖液面高低來調(diào)節(jié)。6、中和與染色

電泳后將載玻片置于平皿內(nèi)。加入 0.4mmol/L Tris-HCl(ph7.5)緩沖液,將載玻片沒入,4℃中和三,每次 10min,棄去 Tris-HCl 緩沖液,每載玻片加 20μL  PI 染液或 EB 染液,蓋上蓋玻片,避光染色10min。

7、觀察、拍照和分析

熒光顯微鏡 515~560nm 波長的激發(fā)光、PI 染色的DNA 圖象呈紅色,EB 染色的DNA 圖象呈桔紅色, 可清楚地觀察到核DNA 和遷移的DNA(即慧星尾)。每個樣本隨機(jī)選擇 100 個細(xì)胞,測定核DNA 直徑和DNA 遷移的長度,可并用相應(yīng)的軟件分析。

 

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