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青島捷世康生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第12年

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琥珀酸脫氫酶(SDH)試劑盒說(shuō)明書

時(shí)間:2021/3/9閱讀:1237
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正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

規(guī)格:分光光度法 50 管/48 樣

測(cè)定意義

SDHEC 1.3.5.1廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。SDH 是線粒體的一種標(biāo)志酶,位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶,是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。此外,為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。

測(cè)定原理

SDH 催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸,脫下的氫通過(guò)吩嗪二甲酯硫酸PMS)傳遞還原 2,6- 二氯酚靛酚DCPIP,并且在 600nm 處具有特征吸收峰,通過(guò) 600nm 吸光度的變化,測(cè)定 26-DPIP 的還原速度,代表 SDH 酶活性。

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:50mL×1 瓶,-20℃保存; 試劑二:10mL×1 瓶,-20℃保存; 試劑三:1mL×1 支,-20℃保存; 試劑四:液體 5mL×1 瓶,4℃保存;

試劑五:粉劑×1 支,4℃保存,臨用前加入 2mL 蒸餾水,用不完的試劑仍 4℃保存; 試劑六:粉劑×1 支,-20℃保存;臨用前加入 2mL 蒸餾水,用不完的試劑 4℃保存。

樣本的前處理

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2 將勻漿 600g4℃離心 5min

3 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g4℃離心 10min

4 上清液即胞漿提取物,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 SDH此步可選做

在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎冰浴,功率 20%或 200W 超聲 3 秒,間隔 10 秒,重復(fù) 30 ,用于線粒體 SDH 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟和加樣表

用蒸餾水調(diào)零后,依次加各試劑到 1 mL 玻璃比色皿中,在加入試劑六的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),混勻,在 600 nm 波長(zhǎng)下記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 1 20 秒時(shí)的吸光度 A2,計(jì)算ΔA=A1-A2

SDH 活性的計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。SDH 活性nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V ) ÷T=1508×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH 活性nmol/min/g  鮮重[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=304.6×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。SDH 活性nmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 樣總)÷T=0.609×ΔA V 反總:反應(yīng)體系總體積,9.5×10-4 Lε2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm d:比色皿光徑,1cmV 樣:加入樣本體積,0.03 mLV 樣總:加入提取液體積,0.202 mL T:反應(yīng)時(shí)間,1 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)。

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