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青島捷世康生物科技有限公司
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乙酰輔酶 A(Acetyl-CoA)含量測定試劑盒說明書

時間:2020/10/12閱讀:1477
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微量法 100 /96

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義

    乙酰輔酶 A 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中。是生物體能源物質代謝過程中產生的一種重要的中間代謝產物。在體內能源物質代謝中是一個樞紐性的物質。糖、脂肪、蛋白質三大營養物質通過乙酰輔酶 A 匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環和氧化磷酸化,經過這條通路*氧化生成二氧化碳和水,釋放能量用于 ATP  合成。此外,乙酰輔酶A 是合成脂肪酸,酮體,膽固醇及其衍生物等生理活性物質的前體物質。

測定原理

    蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD 生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯反應,乙酰輔酶 A 含量和 NADH 的生成速率成正比,340nm 下吸光值的上升速率反應了乙酰輔酶 A 含量的高低。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1 支,-20℃保存。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

試劑三:液體 10uL×1 支,4℃保存。臨用前加入 250μL 試劑五充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

試劑四:粉劑×1 瓶,-20℃保存。臨用前加入 22.5mL 試劑五充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

試劑五:液體 30mL×1 瓶,4℃保存。

工作液的配制:臨用前請根據擬用工作液體積(樣本數×0.23  m  L),將試劑二、三和四按照 1:1:90 的比例混合,或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻(可以測定 96 樣);加樣前置 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)水浴鍋中預熱 30 min;現配現用;

乙酰輔酶 A 的提取

1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量

104 個):試劑一體積(mL)為 500~10001 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

測定步驟

1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min,用蒸餾水于 340nm 處調零。

2、 將工作液置 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)水浴鍋中預熱 10 min

2、取 25μL 樣本和 230μL 工作液至微量石英比色皿或者 96 孔板,混勻,立即記錄 340nm

20s 的吸光值 A1 80s 時的吸光值 A2,計算 ΔA=A2-A1

乙酰輔酶 A 含量計算

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

標準條件下測定的回歸方程為 y = 1640x + 0.012x 為吸光值,y 為標準品濃度(nmol/mL)。

注意:本試劑盒低檢測限為 1.6nmol/mL

(1) 按照蛋白濃度計算

乙酰輔酶A 含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA0.012) ÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。

(2) 按照樣本質量計算

乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×ΔA0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA0.012)

÷W

(3 ) 按照細菌或細胞密度計算:

乙酰輔酶 A 含量(nmol/104)=[(1640×ΔA0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA0.012)÷500

V1:加入反應體系中樣本體積,0.025mLV2:加入提取液體積,1 mLCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500 萬。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下:

標準條件下測定的回歸方程為 y = 3280x + 0.024x 為吸光值,y 為標準品濃度(nmol/mL)。

注意:本試劑盒低檢測限為 1.6nmol/mL

(1) 按照蛋白濃度計算

乙酰輔酶A 含量(nmol/mg prot)=[(3280×ΔA0.024) ×V1]÷(V1×Cpr)=(3280×ΔA0.024) ÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。

(2) 按照樣本質量計算

乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[(3280×ΔA0.024) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(3280×ΔA0.024)

÷W

(3 ) 按照細菌或細胞密度計算:

乙酰輔酶 A 含量(nmol/104=[(3280×ΔA0.024)×V1]÷(500×V1÷V2)=(3280×ΔA0.024)÷500

V1:加入反應體系中樣本體積,0.025mLV2:加入提取液體積,1 mLCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500 萬。

 產品訂購須知:

1、報價含普票運費。。
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3、萬余種化學試劑庫存現貨,3000余種標準品庫存現貨,2000余種即用型試劑染液庫存現貨方便一站式采購,另代理sigma、amresco、美國種草藥、abcam抗體試劑盒、CST 、Santa等進口品牌。

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