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青島捷世康生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第12年

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厭氧培養(yǎng)系列
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載體菌株

glutathione peroxidase, GSH-Px

時(shí)間:2019/7/17閱讀:1422
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                              glutathione peroxidase, GSH-Px

分光光度法 50 /48 

注意:正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

GSH-Px 是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px

不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與 ROS 反應(yīng),生成氧化型谷胱甘肽 GSSG,從而保護(hù)

生物膜免受 ROS 的損害,維持細(xì)胞的正常功能;而且具有保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力、拮

抗有害金屬離子對(duì)機(jī)體的傷害和增加機(jī)體抗輻射等能力。

測(cè)定原理:

GSH-Px 催化 H2O2 氧化 GSH,產(chǎn)生 GSSG;谷胱甘肽還原酶(GR)催化 NADPH 還原 GSSG

再生 GSH,同時(shí) NADPH 氧化生成 NADP+NADPH  340 nm 有特征吸收峰,而 NADP+

沒(méi)有;通過(guò)測(cè)定 340 nm 光吸收減少速率來(lái)計(jì)算 GSH-Px 活性。

自備儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配置:

試劑一:液體 100mL×1 瓶,室溫保存。

試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存。

試劑三:液體 20μL×1 支,-20℃保存。

混合試劑配制:臨用前,在試劑二中加入試劑一 40 mL,充分震蕩溶解后加入全部試劑三,

混勻。(注意:必須現(xiàn)配現(xiàn)用,當(dāng)天使用完)

試劑四:液體 5.1mL×1 瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL) 15~10 的比例(建議稱(chēng)取約 0.1g 組織,

加入 1mL 試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心 10min,取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):試劑一體積(mL)為 500~10001 的比例(建

 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7

秒,總時(shí)間 3min);然后 8000g4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體:直接測(cè)定。

測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 混合試劑在 25℃或者 37℃(哺乳動(dòng)物)水浴中預(yù)熱 30min

3. 測(cè)定管:依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 試劑四、800μL 預(yù)熱的混合試劑、100μL

上清液, 迅速混勻后于 340nm 處測(cè)定第 10 s 和第 190s 的吸光值,分別記為 A 測(cè) 1  A 測(cè)

2,△A 測(cè)定管= A 測(cè) 1A 測(cè) 2

計(jì)算公式:

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義:一定溫度中,每 mg 蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶

活單位。

GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109Cpr×V 樣)÷T

=536×A 測(cè)定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義:一定溫度中,每 g 樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活

單位。

 

GSH-Px (nmol/min/g)=[A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109]÷(W×V ÷V 樣總)÷T

=536×A 測(cè)定管÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:一定溫度中,每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109]÷(細(xì)胞數(shù)量×V ÷V 樣總)÷T

=536×A 測(cè)定管÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

活性單位定義:一定溫度中,每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/mL)=[A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109]÷V ÷T

=536×A 測(cè)定管

εNADPH 摩爾消光系數(shù) 6.22×103L/mol/cmV 反總:反應(yīng)體系總體積,1000μL=0.001 L

1061mol=1×106μmol Cpr:上清液蛋白濃度(mg/mL);V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體

積,100μL =0.1 mLV 樣總:加入提取液體積,1mLW,樣本質(zhì)量,gT:反應(yīng)時(shí)間,3

min

注意事項(xiàng):

1)樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力;

2)混合試劑和底物液須臨用前配制,配完后置于冰上,當(dāng)天使用完;

3)測(cè)定過(guò)程操作須迅速;

4)細(xì)胞中 GSH-Px 活性測(cè)定時(shí),細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬(wàn)-500 萬(wàn)之間,細(xì)胞中 GSH-Px 的提

取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。

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