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多篇 SCI 發現用 RIPA 提蛋白存在問題，我們該如何應對？
這篇綜述重點說明使用 RIPA 裂解液提取總蛋白以及下游實驗中可能存在的問題。
RIPA 裂解液常用于從脊椎動物細胞和組織中提取總蛋白 [1]。但是由于蛋白質間有較大的差異和非蛋白成份的干擾，所以從一個樣本中同時釋放和溶解所有蛋白質是非常困難的。特別是一些整合到膜上的蛋白質，或與其他蛋白質 / 核酸形成復合物時，就大大阻礙了提取效率。因此可以推斷，蛋白質在提取過程中或多或少的與在體內時情況不盡相同。
經典 RIPA 裂解液中含有低濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS 變性劑），脫氧膽酸（干擾蛋白質間相互作用）及其他成分。雖然 RIPA 裂解液經過不斷改良使用，但是 RIPA 提取蛋白通常會產生兩個不同的部分：即 RIPA 可溶組分和 RIPA 不可溶組分。 一般來說，只有 RIPA 可溶組分被用于下游實驗，而 RIPA 不可溶組分被丟棄。這樣提取的蛋白在使用中會存在哪些問題呢？
先來看些文獻數據：
研究發現，不同的蛋白在 RIPA 裂解液中溶解性不同，例如 F9 中的纖維連接蛋白不溶于 RIPA 裂解液 [2] 。而小鼠額葉樣品中在 RIPA 可溶組分和非可溶性組分中含有相同量的 Septin 7 [3]（下圖），表明用 RIPA 裂解液提取這些特定蛋白質的效率十分低。
近年來，越來越多的研究者密切關注 RIPA 不可溶組分中的蛋白質組分，以及它們對下游實驗和整體數據的影響。Bai 和 Laiho 用 RIPA 裂解液從 Hela 細胞核中提取蛋白，發現可溶性組分和不可溶性組。
分的蛋白質圖譜差異很大，表明蛋白質的丟失不成正比 [4] （下圖）。
Mukhopadhyay 等 [5] 從突變小鼠的乳腺上皮細胞中提取總蛋白，發現在 RIPA 不可溶組分中，通過 WB 很容易檢測到 EGFR, HSP90, c-Src, 和 tubulin，表明這些蛋白在 RIPA 不可溶組分中大量存在（下圖）。
Wang 等 [6] 對比 SDS 加熱法和 RIPA 裂解液法從斑馬魚肝臟腫瘤中提取蛋白，發現 RIPA 裂解液提取這些樣品時對于大分子量蛋白的提取效率十分低（下圖）。
Li[7] 對比了從小鼠脾臟和肝臟中提取總蛋白 RIPA 可溶和不可溶性組分以及基于離心管柱法商業試劑盒提取的蛋白質圖譜，發現 RIPA 不可溶組分蛋白質圖譜與可溶性組分圖譜相似，但是不*相同。這些丟失的不可溶組分覆蓋了整個蛋白質圖譜分子量范圍，不同樣品的不可溶組分也有細節上的差異。不同樣品的蛋白質丟失是不可預測的。然而，商業試劑盒提取蛋白不產生不可溶組分，更快速，可獲得更高產量更完整的蛋白質圖譜（下圖）。
Ngoka [8] 用質譜平行對比了幾組乳腺癌 RIPA 可溶組分和不可溶組分的蛋白質圖譜。結果發現，使用含尿素的裂解液提取 RIPA 不溶性組分中的平均分子量蛋白質含量比可溶性組分高 60% 。換句話說，許多大分子量蛋白質被丟失在 RIPA 不可溶組分中。研究還表明，幾乎所有的細胞外基質（ECM）和許多細胞骨架蛋白被發現在 RIPA 不可溶組分里。這些結果表明，由于蛋白丟失在不可溶組分中產生了偏差, RIPA 提取蛋白的蛋白質譜是不*的。
利用 RIPA 裂解細胞后一個主要用途是進行目標蛋白的定性和 / 或定量分析 [9,10,11]。zui近一篇綜述報道了影響定量免疫印跡的關鍵因素 [12]，在這項研究中，tubulin, lamin A, KRT5 顯示大量丟失在 RIPA 不可溶組分中。zui值得注意的是，組蛋白 H3K4me2 發現僅僅存在于 RIPA 不可溶組分中。轉錄因子 GATA-2 和黏附分子β-catenin 也出現在不可溶組分中。研究中的另一個重要發現是樣品制備方法對實驗結果有顯著影響。Janes [12] 對比了 NP-40，RIPA 裂解液和 Laemmli 裂解液的作用，用 WB 檢測切割形式的 caspase-8，發現使用 Laemmli 裂解液的樣品中可以檢測到，而使用 RIPA 裂解液樣品中沒有檢測到，證實了 RIPA 裂解液不適合用于這類型的分析。
利用 RIPA 裂解液提取的蛋白還被發現會人為的增加了某些蛋白激酶的活性。用 RIPA 裂解液裂解結腸癌細胞比用 NP-40 裂解后體外蛋白酶活性升高了 5-7 倍 [13]。Zapata[14] 等人，對比用 RIPA 和 2%SDS 提取活化的 T 淋巴細胞 caspase 的活性，發現 RIPA 裂解液通過釋放 GraB 人工激活 caspase-3。這些結果強烈建議大家在使用 RIPA 裂解液時要做好應對數據解讀的預案。
如上所述，使用 RIPA 裂解液提取總蛋白由于蛋白的丟失會產生很多問題。
就總蛋白而言，提取過程中
(1) 丟失的蛋白會引起蛋白圖譜的變化
(2) 改變不同種類蛋白的比例
(3) 改變某些蛋白的活性。
下游實驗中可能存在的問題：
（1） 使用 RIPA 裂解液提取蛋白做 WB 會人為的增強或降低某些信號強度。RIPA 裂解液提取蛋白已經被證實有 10-30% 的蛋白會丟失在不可溶組分中 [12]。
（2） 如果一個細胞 / 組織樣品中某些特定的蛋白質可以在可溶組分和不可溶組分間轉變，或者像上面所述受激活狀態影響 [12] 的情況下，數據的解釋可能成為一個大問題。
（3） RIPA 裂解液提取的蛋白不適合用于目標蛋白的定性和 / 或定量分析。
理想的總蛋白提取應該是什么樣的呢？
（1） 獲取給定樣品中完整的蛋白質圖譜，要真實的反映所有蛋白質種類和比例。大多數研究人員認為他們采用的總蛋白提取方法已經反映了體內目前的情況，但是很少有人真正的通過平行實驗對比不同的提取方法。在許多情況下，很可能真實的蛋白質圖譜和研究者相信的結果不*相同。
（2） 獲取zui大的蛋白質溶解度，zui少的蛋白質損失以及得到完整的蛋白質圖譜才是蛋白質提取zuijia的選擇。