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GST融合蛋白純化常見問題解答
一、GST融合蛋白
GST（谷胱甘肽轉移酶）能特異的與谷胱甘肽結合，表現為酶和底物的作用原理，利用這個原理，將GST做成標簽表達出融合蛋白，與帶谷胱甘肽配基的親和介質特異性結合，從而純化出目標蛋白，GST融合蛋白純化的特點有：純度高、純化條件溫和保持蛋白活性、促進蛋白可溶性表達等。
二、GST蛋白結合效率太低
1.可能原因：上樣流速太快，結合時間太短
解決方案：GST親和層析是利用GST (glutathione-S-transferase )融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過硫鍵共價親和結合，GST與谷胱甘肽的結合相對緩慢，比金屬螯合親和層析純化his蛋白結合要緩慢很多。上樣流速太快，會影響結合效率。GST親和層析時流速適當減慢，保證足夠的結合時間。
2.可能原因：緩沖液不合適，柱子平衡不到位
解決方案：GST親和層析時緩沖液的pH應控制在6.5到8.0的之間，并保證足夠的平衡體積數，讓填料處于可以使用的狀態，一般平衡10個柱床體積。
3.可能原因：樣品中GST融合蛋白濃度太低
解決方案：因GST層析時，GST融合蛋白豐度太低時影響結合效率。對于低豐度的樣品應先濃縮，在層析純化。或者選則匯研生物的高載量GST-4FF填料。
4.可能原因：GST蛋白發生變性或聚集
解決方案：
1）胞內表達的蛋白在細胞破碎時應選則合適的破碎方式，避免蛋白碳化或者變性。
2）發生聚集可以嘗試添加1-10mM的DTT，促進蛋白的溶解。
3）GST蛋白和核酸結合或者蛋白之間結合，可以適當的添加氯化鈉（100-300mM)
三、GST蛋白洗脫困難
1.可能原因：洗脫強度不夠
解決方案：
1）增加洗脫體積數。
2）一般使用中建議的10mM濃度對于大多數應用來說足夠了，但是也存在例外。可以嘗試使用50mM Tris-HCl，20-40mM 還原型谷胱甘肽，pH8.0作為洗脫緩沖液。
3）洗脫緩沖液pH過低時，應調整pH到8-9.
4）洗脫緩沖液的離子強度不宜太低，應控制在100-300mM氯化鈉濃度。
2.可能原因：非特異性吸附
解決方案：洗脫緩沖液中加入1%的TritonX-100或2%的可以顯著提高某些GST標簽蛋白的洗脫，降低非特異性吸附和蛋白之間的吸附。
3.可能原因：洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了
解決方案：洗脫緩沖液需現配現用，GTH務必使用時在加入緩沖液中，也可嘗試加入1-5mM的DTT。
四、GST蛋白純化后純度太低
1.可能原因：GST融合蛋白降解
解決方案：
1）層析體系中加入蛋白酶抑制劑,防止標簽蛋白降解。
2）GST標簽部分脫落，檢查序列，在宿主細胞表達的過程，宿主細胞代謝的酶使GST-tag和目的蛋白分開，此時可嘗試換宿主細胞或者優化序列。
2.可能原因：輔助表達的蛋白被表達
解決原因：一些蛋白的表達常常需要其它蛋白輔助表達，如分子伴侶等。一些從這些共純化的蛋白中分離GST標簽蛋白的方法已經發表。如：DnaK，有報道這種相互作用可以通過上樣前在50mM Tris-HCl，2mM ATP，10mM MgSO4，pH7.4中37°C溫浴10分鐘而破壞。或者通過ATP-agarose或相似的純化介質或進行離子交換層析來除去。
五、GST蛋白的表達
1)采用RT-PCR 擴增得到目的基因，構建到表達載體（PGEX-4T-1）上； 2)用構建質粒轉化表達菌BL21，LB 平板37℃；
3)LB 平板上挑取單一菌落接入5mL LB 培養基（100ug/mL Amp）中，37℃培養3~5h； 4)將5mL 菌液接入1L LB（100ug/mL Amp）液體培養基中，37℃培養至OD600≈0.6，加入0.3mmol/L 的IPTG，
5)20℃誘導16h；
6)將培養好的菌液于5000r/min 離心10min，棄去上清液，收集菌體，離心后菌體沉淀懸浮 于25mL Binding buffer 中。