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把要退火的DNA oligo用經滅菌的三蒸水配制成50μM。解凍Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)，混勻備用。如經常使用，本Buffer可放置2-8℃一個月。
2. 如下設置退火反應體系：
| Annealing Buffer for DNA Oligos(5X) | 20μl |
| DNA oligo A(50μM) | 20μl |
| DNA oligo B(50μM) | 20μl |
| Nuclease-Free Water | 40μl |
| 總體積 | 100μl |
按照上述順序依次加入各種試劑，混勻。放入PCR儀。
3. 如下設置PCR儀進行退火反應：
| 步驟 | 溫度 | 時間 | 說明 |
| 1 | 95℃ | 2分鐘 | 讓oligo充分變性 |
| 2 | 每8秒下降0.1℃，降25℃(注1) | 約90分鐘 | 退火 |
| 3 | 4℃ | 長時間保持 | 暫時存放 |
注1：如果所用的PCR儀不具備下降0.1℃的功能，也可以設置為每90秒下降1℃。
4. 退火結束后可以直接用于連接反應，也可以在-20℃凍存備用。如果退火結束后打算進行酶切等其它反應，好用純化試劑盒進行純化，或者確保退火產物在反應體系中體積不超過10%，以避免AnnealingBuffer對后續的酶反應體系的干擾。
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