化工儀器網
技術文章
默克生命科學 | DNA和蛋白質去磷酸化操作流程
閱讀：1130 發布時間：2024-1-5去磷酸化指的是水解去除磷酸(PO43?)基團的過程。在對蛋白質或DNA去磷酸化時，需要使用酶或水解酶切割酯鍵。例如，磷酸酶可將磷酸單酯水解為磷酸根離子和帶有游離羥基(OH)基團的分子，從而去除磷酸基團。 默提供各類生命科學解決方案和服務
1.利用小牛腸堿性磷酸酶對DNA進行去磷酸化
材料
牛小腸堿性磷酸酶（貨號 P4978）
10X CIP緩沖液（貨號C3225）
1 M NaCl
0.5 M Tris-HCl，25 °C下pH 7.9
0.1 M MgCl2
0.01 M 二硫蘇糖醇
存儲緩沖液
10 mM Tris-HCl, pH 8.2
50 mM KCl
1 mM MgCl2
0.1 mM ZnCl2
50%甘油
操作流程：
1X CIP緩沖液溶解DNA(0.5 µg DNA/10 µL)。
對于5’突出的粘末端DNA加入0.1單位/皮摩爾的CIP；對于3'突出的粘末端或布路姆試劑加入1單位/皮摩爾。
在37℃孵育60分鐘。
苯酚/氯仿2（貨號P3803 或P2069）提取或凝膠純化DNA。*
乙醇沉淀法恢復DNA。2
*注意：苯酚提取或凝膠純化后無需再熱滅活。
熱滅活：對于牛腸酶，在5毫摩爾/升的乙二胺四乙酸下，加熱至75℃10分鐘，可使95%以上的活性失活。 注意：大腸桿菌的堿性磷酸酶比牛腸酶在高溫下更穩定，也更耐熱滅活。