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多重熒光免疫組化Q&A——第一彈
Q：我想要進行多色實驗，對于我的樣本有什么要求嗎？
A：您按照免疫組化的標準對您的樣本進行前處理即可。如果是從歷史切片或者蠟塊中挑選用來做多色，請盡量選取相對較新的樣本（一個月內），最長不要選保存超過半年的樣本，可能會有靶點缺失或者強非特異性，導致染色效果欠佳。
附上石蠟切片樣本處理推薦：
取新鮮組織（理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm），如取的組織過大，需要切小后再做固定，以免組織太厚固定液滲透不良，導致后續染色效果不佳
組織離體后（不要超過30分鐘）迅速轉移到固定液中（一般選用10%中性福爾馬林或4%多聚甲醛），在常溫條件下固定時間為18-24小時，不要固定太長時間，容易導致組織抗原丟失，影響陽性信號顯色。
浸蠟溫度應控制在58~60℃左右，浸蠟用的石蠟應經常更換，以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發脆，細胞收縮，容易導致后續染色過程中組織脫片。
切片厚度最佳為4微米，組織太厚容易導致染料滲透不加，且多層細胞之間熒光發生串擾，影響成像觀察。貼片需選用免疫組化專用的防脫載玻片，不要在水浴撈片環節添加任何粘合劑，撈片后豎直置于吸水紙上去除水分，輕敲去除水滴，不要用紙擦拭玻片。
切片在45℃~65℃烤箱中烤片30-60分鐘左右，到干片為止，否則后續染色過程中易脫片。但需要注意溫度過高或時間過長均會影響抗原的活性，因為在高溫干燥條件下會加速組織切片中抗原的氧化。
Q：如果我的樣本是冰凍切片或者細胞爬片，可以用來做多色實驗嗎？
A：可以的，多色實驗本身不局限您的樣本類型，但需要注意的是您的切片或者爬片能否經得起多輪抗體洗脫，在樣本不脫片的情況下，才能有一個比較好的染色效果。如果您是這類樣本，您需要額外準備一瓶抗體洗脫液（abs994），替代多色實驗中的熱修復步驟，采用溫和的洗脫方式，避免高溫高壓破壞切片。需要注意的是，您依舊需要控制切片厚度，盡量保證在單層細胞的厚度，如太厚，多層細胞之間發生重疊，熒光信號會發生串擾。
（PS：石蠟切片是適合做多色實驗的樣本類型！）
Q：我該如何選擇用于做多色的抗體呢？
A：多色這項技術突出的一個優勢就在于對一抗種屬沒有特殊的限定，根據樣本種屬選擇即可，我們試劑盒本身配備了二抗（鼠兔通用二抗或者抗兔二抗），您在選取一抗來源的時候，盡可能選擇兔子或者小鼠來源的一抗，如確實找不到鼠或兔來源的一抗也沒有關系，您只需要再準備一個跟該一抗來源適配的能用于免疫組化的HRP二抗即可。另外，您的一抗需要能應用于IHC，并且盡量選擇單克隆抗體，多抗往往容易產生非特異性。
Q：我注意到你們多色試劑盒中也是熒光染料，我在操作過程中需要額外避光嗎？
A：不用的，您在常規日光燈環境下操作就可以，我們染料的熒光強度很高，不會那么容易淬滅，但涉及到需要孵育或者保存的時候還是建議您采用避光濕盒進行。
Q：我今天做好了多色片子，但無法立即進行掃描觀察，我該怎么保存呢？
A：染好的多色片子可以避光在4℃條件下保存較長的時間，但我們建議您完成染色以后，在兩周內完成成像，并且如果需要長時間保存，建議您用透明指甲油對蓋玻片邊緣進行密封。如保存時間過長，或保存不當，封片劑容易干掉，此時再成像會有較強非特異性，可以使用PBS把蓋玻片洗下來，重新封片以后再觀察，但成像效果依舊會打折扣，還是建議您盡快完成成像。
（PS：雖然熒光染料沒有那么容易淬滅，但若多次成像反復激發，依舊會淬滅，2-3次影響不會很大，但不排除偶然性哦）
Q：整個多色實驗一般需要多久能夠完成呀？一天能行嗎？
A：如果您的指標比較少（2~3個指標），恰好您又是“肝帝"愿意熬夜做實驗，那么一天是可以做完的哦，因為我們多色染料有信號放大的功能，且試劑盒搭配的二抗是多聚的HRP二抗，也能放大信號，因此原本需要4℃過夜的一抗孵育，可以在室溫1小時，或者37℃烘箱一小時完成，滿打滿算一天是可以做完實驗的。但如果您不想要這么“肝"，當然可以，您只需要在一抗孵育的步驟選擇4℃過夜，第二天再來繼續做二抗孵育等后續操作就行，跟您做IHC實驗一樣，當您指標比較多的時候，可以合理安排，部分抗體室溫1小時，部分抗體4℃過夜，但也不可把“戰線"拉得太長，控制在盡可能短的時間完成實驗，畢竟遲則生變哦。
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| 免疫檢查點：PD-1、PD-L1、HLA-DR、TIM-3、GZMB、CD24、LAG-3 | 巨噬細胞：F4/80、CD68、CD86、CD11b、CD163、M-CSF |
| 成纖維細胞：α-SMA | 腫瘤相關：SHP-2 |
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