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丙酮酸脫氫酶(PDH)試劑盒操作步驟詳解

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丙酮酸脫氫酶(PDH)試劑盒

測定意義 PDH(EC 4.1.1.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶,催化丙酮酸脫梭生成TPP,把糖酵解和三羧酸循環連接起來。

測定原理 PDH催化丙酮酸脫氫,同時還原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),從而導致600nm光吸收的減少。 需自備的儀器和用品 可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。 試劑的組成和配制 試劑一:50mL×1瓶,-20℃保存; 試劑二:10mL×1瓶,-20℃保存; 試劑三:1mL×1支,-20℃保存; 試劑四:液體50mL×1瓶,4℃保存; 試劑五:粉劑×1支,4℃保存; 試劑六:粉劑×1支,4℃保存; 試劑七:粉劑×1支,4℃保存; 試劑八:粉劑×1支,4℃保存; 工作液的配制:臨用前把試劑五、試劑六、試劑七和試劑八轉移到試劑四中混合溶解待用。 PDH的提取
1、 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 4 ℃ 600 g離心5min。
3、 將上清液移至另一離心管中,4 ℃ 11000 g離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的PDH(此步可選做)。
5、 在沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(功率20%,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于PDH活性測定。
丙酮酸脫氫酶(PDH)試劑盒測定步驟
1、 調零
用蒸餾水于605nm處調零。
2、 樣本測定
(1)取900μL工作液加入1mL玻璃比色皿,在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)中孵育5min。 (2)取出比色皿,加入50μL酶液,混勻;立即記錄605nm處初始吸光值A1,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)中準確反應1min,記錄605nm處1min后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。 注意事項 1、測定過程中所有試劑和樣本在冰上放置,以免變性和失活。 2、比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃,取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水,將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
3、兩個人同時做此實驗,一個人比色,一個人計時,以保證實驗結果的準確性。

PDH活性計算 1、組織中PDH活性計算: (1) 按樣本蛋白濃度計算 單位的定義:每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH活性(U/mg prot)=反應總體積(950μL)÷樣本體積(50μL)÷反應時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(21×10-3)×ΔA ÷蛋白濃度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白濃度(mg/mL) (2) 按樣本鮮重計算 單位的定義:每g組織在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH(U/g 鮮重)=反應總體積(950μL)÷樣本體積(50μL)÷反應時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(21×10-3)×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL)=905×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL) 2、細菌或培養細胞中PDH活性計算: (1)按樣本蛋白濃度計算 單位的定義:每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH活性(U/mg prot)=反應總體積(950μL)÷樣本體積(50μL)÷反應時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(21×10-3)×ΔA ÷蛋白濃度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白濃度(mg/mL) (2) 按細菌或細胞密度計算 單位的定義:每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH活性(U/104 cell)=反應總體積(950μL)÷樣本體積(50μL)÷反應時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(21×10-3)×ΔA ÷細菌或細胞密度(104 cell /mL)=905×ΔA÷細菌或細胞密度(104 cell /mL)

丙酮酸脫氫酶(PDH)試劑盒

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