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如何用考馬斯亮藍染色法 (Bradford法)測定蛋白質含量

時間:2013/10/10閱讀:2111
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目的和要求

掌握考馬斯亮藍法測定蛋白質含量的原理和方法。學習分光光度計的原理及使用法。

原理

1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍G250與蛋白質結合的原理,迅速、敏感的定量測定蛋白質的方法。染料與蛋白質結合后引起染料zui大吸收的改變,從465nm變為595nm,光吸收增加。蛋白質染料復合物具有高的消光系數,因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度,zui低檢出量為1μg蛋白。染料與蛋白質的結合是很迅速的過程,大約需2min,結合物的顏色在1h內是穩定的。一些陽離子,如K+,Na+,Mg2+,(NH 4 ) 2 SO 4,乙醇等物質不干擾測定,而大量的去污劑如TritonX100,SDS等嚴重干擾測定,少量的去污劑可通過用適當的對照而消除。由于染色法簡單迅速,干擾物質少,靈敏度高,現已廣泛應用于蛋白質含量的測定。

操作步驟

一、標準方法

取含 10~100μg蛋白質溶液于小試管中,用雙蒸水或緩沖液調體積到0.1mL,然后加入5mL蛋白試劑,充分振蕩混合,2min后于595nm測定光吸收值。以0.1mL雙蒸水或緩沖液及5mL蛋白試劑作為空白對照。

二、微量蛋白分析法

取含 1~10μg蛋白質溶液,用雙蒸水調體積到0.8mL,加0.2mL蛋白試劑,充分振蕩混合, 2min后于595nm測定光吸收值,以0.8mL雙蒸水及0.2mL蛋白試劑作為空白對照。用不同濃度的蛋白質溶液作標準曲線,以蛋白質濃度為橫坐標,光吸收值為縱坐標,繪制標準曲線作為定量的依據。

試劑和器材

一、試劑

1.標準蛋白質溶液:可用牛血清清蛋白預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,根據其純度配制成1mg/mL的溶液。或根據牛血清清蛋白的紫外消光系數A 1% 1cm=6.6來確定。

2.蛋白試劑的配制:稱取100mg考馬斯亮藍G250溶于50mL95%乙醇,加入100mL85%(W/V)磷酸,將溶液用水稀釋到1000mL。試劑的終濃度為0.01%考馬斯亮藍G250,4.7%(W/V)乙醇,和8.5%(W/V)磷酸。

二、器材

1.72型分光光度計

2.微量注射器

3.試管及試管架

4.刻度吸管

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