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ELISA試劑盒研究----DNA氧化損傷產物8-OHdG在終末期腎病表達

時間:2013/9/6閱讀:1386
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     經研究證實,終末期腎病(ESRD)患者存在氧化損傷增強。ESRD患者體內某些細胞因子(IL-1、IL-6、TNF等)分泌增加,可使中性粒細胞、單核-巨噬細胞等炎癥細胞的呼吸爆發活動增強,活性氧(ROS)和活性氮(RNS)大量生成。

       ROS和RNS可攻擊細胞內任何結構和物質,包括:DNA。DNA氧化損傷產物中,作為DNA中脫氧鳥苷(dG)的羥基加合物,8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)因其形成量大,影響因素少,已被*為zui能反映體內DNA氧化損傷程度的生物標志物。然而目前對ESRD的DNA的氧化損傷研究尚少。本研究通過檢測血清中的8-OHdG含量來了解ESRD患者體內DNA氧化損傷程度,同時研究不同病因(慢性腎小球腎炎和糖尿病)所致ESRD在DNA氧化損傷程度上是否有差別,以及血液透析和抗氧化治療對DNA氧化損傷的影響。本研究還檢測了ESRD患者一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)的含量,并通過與8-OHdG比較,來了解DNA氧化損傷與其他物質氧化損傷的相關性。以此達到探討ESRD患者體內氧化損傷的機制,并為ESRD的抗氧化治療提供理論依據的目的。 實驗材料與方法 一、實驗材料 1.主要試劑與儀器 8-OHdG ELISA試劑盒購自日本防老化研究所(Japan Institute For The Control Of Aging);鎘顆粒購自上海化學試劑站;722光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠);酶標儀(芬蘭產,Multi-skan Ascent牌) 二、實驗方法 二.研究對象: 分四組,每組10例。除正常對照組外,其余三組為實驗組。*組為正常對照組。第H組為慢性腎小球腎炎導致ESRD未接受血液透析治療組*N非透析組人第三組為糖尿病導致ESRD末接受血液透析治療組pM非透析組八第四組為慢性腎小球腎炎導致ESRD接受血液透析治療組*N透析組人 以上各組除第四組外,所有受檢者均要求無吸煙史,無腫瘤病史;近一月無感染史,近一月無口服VOVD鐵劑史。第四組均為接受血液透析治療三個月以上,要求除口服VOV卜鐵劑史外,其余同其他三組。 2.檢測方法: 8-OHdG檢測采用 ELISA試劑盒法,依次加人*抗體液、第二抗體液后,再加人發色劑及反應停止液,然后酶標儀波長450run處8-OHdG定量分析。NO采用檢測改良鍍銅輻顆粒還原法。MDA檢測采用硫代巴比妥酸產物比色法。 三、統計分析 實驗數據采用SPSS.0統計分析軟件進行描述分析t檢驗及數據相關分析,數據以 i幻表示,p<0.05為統計學有意義。 結 果 一、各組間血清 8-OHdGJDA和 NO測量值 l.各組的血清8-OHdG水平 GN非透組刀M非透組人N透析組血清中8—OHdG水平均顯著高于正常對照組,p<0.0L但各實驗相比鰍顯著差異,p>0.05。 ·2·. 2.各組的血清MDA水平 GN非透組山M非透組血清中MDA水平均顯著高于正常對照組,p<0.of。實驗組中 GN非透組與 GN透析組相比差異顯著,P<0.01。 3.各組的血清NO水平 GN非透組山M非透組血清中NO水平均顯著高于正常對照組,其中*N非透組對比正常對照組p<o.o\*M非透組與正常對照組比 p<0.05。但 GN非透組的 NO水平明顯高于 DM非透組,差異顯著,p北·01。 二、不同氧化損傷指標與肌酥的相關分析 l.血清8-OHdG值同NO和o值呈正相關,相關系數分別為0.379和0.596。其中 8-OHdG值和 Cr值呈較強正相關,P<0.of。 2.血清 NO值與 Cr值呈正相關,相關系數為0.378,P<0.05。 討 論 關于DNA氧化損傷的研究是近幾年才開展起來的。在DNA氧化損傷產物中,8-OHdG產生量zui多。8-OHdG為 DNA中 dG的羥基(·OH)加合物。。OH的生成方式主要是Fenton反應(H。O。+Fe‘“一+HO+Fe’”+·OH),其中鐵離子發揮著重要作用。以前8—OHdG的檢測復雜,費用昂貴,限制了8-OHdG的應用。1997年日本防老化研究所研究出 ELISA方法檢測 8-OHdG,可直接檢測血清中的8-OHdG含量,大大地提高了8-OHdG作為一個DNA氧化損傷指標的應用,本研究也是基于此方法研究ESRD中 DNA氧化損傷水平。 我們的研究結果顯示在ESRD患者8-OHdG水平明顯高于 ·3·正常對照組。而且8-OHdG同患者體內Cr水平明顯正相關,說明ESRD患者DNA氧化損傷增強是腎功能衰竭的結果。ESRD患者有多種因素導致Fenton反應增強。這些因素包括:ESRD患者促紅細胞生成素減少等原因導致鐵的利用減少和轉運障礙。鐵元素蓄積;患者營養不良、蛋白合成減少、體內微量元索硒重度減低等原因,導致GSH-PX和GSH抗氧化系統功能低下,體內·OH清除減少;SODJO*抗氧化物缺乏等。

    本研究發現GN非透組和DM非透組之間8—OHdG的水平無差別,這與目前的一些研究結果不同。之所以不同的原因,我們考慮可能是因為檢測標本有差別。(轉自 論文網)

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