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Real-time qPCR如何進行數據分析
1. Real-time qPCR常見參數
基線（baseline）
通常是3-15個循環的熒光信號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線
閾值（threshold）
自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍
手動設置：置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強
同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Ct值:與起始濃度的對數成線性關系。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。2. 影響Ct值的關鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內，使Ct在15-35之間
反應液成分的影響
任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。3. 如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。另一個評估PCR效率的關鍵參數是相關系數R2，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準確預測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時，兩個數值之間相關的可信度很好。
標準偏差（standard deviation，偏差的平方根）是的精確度計量方法。
如果許多數據點都靠近平均值，那么標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。實際上，足夠多重復次數產生的數據組會形成大致的正態分布。這經常可通過經典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態分布。如果PCR反應效率是 100%，那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小于等于0.167。標準偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小于等于 0.250
Real-time qPCR如何進行數據分析
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