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BLI變身PLI? Octet又又又解鎖新應用！
利用噬菌體病毒選擇性感染和殺死致病菌，稱為噬菌體療法。目前，噬菌體篩選的主要手段包括基于光學的測定，不能在復雜的介質(zhì)中進行，如有色溶液、不均勻混合物或高粘度樣品。
為應對這些挑戰(zhàn)，研究人員采用基于生物層干涉技術（Biolayer interferometry，BLI）的Octet®非標記分子互作分析系統(tǒng)，建立了噬菌體層干涉術（Phage-layer interferometry，PLI）作為噬菌體伴隨診斷方法[1]。
PLI不僅為一種定量的噬菌體篩選方法，同時可以作為細菌檢測平臺。PLI易于自動化，還可以在復雜、不透明的介質(zhì)中發(fā)揮作用，如嬰兒配方奶粉。PLI方法的建立，將對預防食源性疾病及對抗AMR（抗生素耐藥性）產(chǎn)生直接而廣泛的影響。那么，PLI技術又是如何誕生的呢？接下來讓我們一睹為快！
圖1. PLI實時監(jiān)測細菌結合和裂解：
第1步，baseline,緩沖液平衡；
第2步，噬菌體固化在Octet®傳感器上；
第3步，細菌結合；
第4步，緩沖液中解離
PLI方法開發(fā)
鑒于噬菌體T7展現(xiàn)出極高的治療潛力，研究者因此選擇其來合成噬菌體功能化的BLI傳感器，用作PLI噬菌體生物傳感器的原型。首先，將純化的T7進行生物素化，并通過透析法去除多余生物素，然后T7-bio就可以固化在SA傳感器上。
上圖：噬菌體生物素化示意圖；左圖：T7噬菌體固化的信號較高，說明其可以成功固化在SA傳感器上
圖2. T7噬菌體生物素化和傳感器固化示意圖
研究人員通過掃描電子顯微鏡（SEM）進一步確認了傳感器表面的T7的功能化不受影響。固化后的噬菌體平均長度和直徑分別為85±15nm和66±11nm，與之前研究報道的3D 冷凍電子斷層掃描衍生模型計算出的尺寸非常吻合。由于Octet®傳感器是由玻璃光纖制成，可以在SEM下直接觀察。
圖3. 固定化T7顆粒的代表性SEM圖像與冷凍電子斷層掃描3D模型的比較
PLI方法評估
噬菌體宿主范圍篩選：將T7傳感器浸沒在細菌肉湯培養(yǎng)物中并通過PLI信號隨時間的變化來研究噬菌體-宿主動力學。通過BW25113（敏感菌株）和BW25113 ΔwaaCΔtrxA（耐藥菌株）進行測試，發(fā)現(xiàn)BW25113與T7傳感器的結合信號更強，并進行重復試驗確認了PLI良好的重復性。這一發(fā)現(xiàn)證明PLI在研究噬菌體宿主范圍時可通過比較噬菌體結合能力參數(shù)進行篩選。
圖4.細菌結合的PLI信號：BW25113（敏感菌株）PLI信號比BW25113 ΔwaaCΔtrxA（耐藥菌株）高
量化噬菌體感染參數(shù)（如宿主結合和潛伏期）：細菌結合后將傳感器洗滌并在LB中孵育測量裂解動力學。由于細菌解離，BW25113和BW25113ΔwaaCΔtrxA前期檢測信號略有下降。120分鐘后，BW25113信號急劇增加后迅速降低，表明噬菌體感染引起細菌腫脹后裂解（劃重點！在解離觀察到信號起伏就說明細菌被噬菌體裂解了！）。而BW25113ΔwaaCΔtrxA沒有產(chǎn)生“裂解”信號。考慮到PLI是實時的檢測，所以在PLI中可觀察到單個感染周期，因此可以推斷噬菌體潛伏期，T7在室溫下的潛伏時間為193 ± 26分鐘。通過PLI測定潛伏期與傳統(tǒng)方法相比操作更為簡單。
圖5.在解離步驟中，PLI發(fā)現(xiàn)BW25113細菌裂解
研究人員還通過SEM確認了傳感器的細菌裂解碎片上覆蓋著T7（白色顆粒），從而證實噬菌體傳感器誘導的細菌裂解。
圖6. 傳感器表面上細菌裂解和裂解產(chǎn)物的代表性圖像：C圖為菌體開始裂解，但是菌體相對完整；D，E圖為裂解后的細菌，并附著噬菌體
PLI實戰(zhàn)1—能被噬菌體裂解的細菌篩選
研究人員使用ECOR集合（該集合包括來自世界各地的大腸桿菌菌株）中的30種細菌篩選T7宿主范圍，并與傳統(tǒng)的噬菌體篩選方法DLA(雙瓊脂覆蓋試驗)進行對比。結果顯示PLI比傳統(tǒng)方法具有更高靈敏度，如ECOR-16在DLA測定中未被確定為敏感，但在PLI檢測中觀察到裂解信號后，重新分析DLA培養(yǎng)皿，可在最濃縮的稀釋度下顯示出小斑塊。可見，PLI測量噬菌體宿主范圍的能力更強，并易于比較噬菌體感染參數(shù)如宿主結合動力學和潛伏期，從而實現(xiàn)更標準化的噬菌體候選物篩選過程。
圖7. PLI檢測ECOR集合中 30 種菌株的結合和裂解
PLI實戰(zhàn)2—奶粉中診斷細菌
由于噬菌體通過結合細菌來診斷細菌的存在，而Octet®具有在復雜樣品中檢測的能力，因此研究人員將PLI用于檢測嬰兒配方奶粉的細菌污染。嬰兒配方奶粉是不透明的，很難通過傳統(tǒng)的光譜方法進行分析。將T7生物傳感器浸入嬰兒配方奶粉中檢測，與未污染的奶粉相比受污染的奶粉的結合信號更高。在LB培養(yǎng)基中解離，觀察到受污染的奶粉檢測信號存在裂解特征，未污染的奶粉僅顯示非特異性結合分子從傳感器表面的解離信號。
圖8. ?PLI檢測污染的嬰兒配方奶粉：左圖，在奶粉中，噬菌體結合細菌PLI信號；右圖，在LB培養(yǎng)基中解離，發(fā)現(xiàn)細菌的裂解信號
Octet®還提供其他配套的傳感器固化病毒，比如本文還用AR2G（氨基偶聯(lián)）傳感器結合帶正電荷的聚乙烯亞胺（PEI）聚合物，再捕獲與噬菌體結合的細菌，并進行檢測，其結果與生物素化后固化在SA傳感器結果類似。
以上就是BLI變身PLI的全過程，PLI之所以適合于復雜樣本檢測以及長時間（400-500mins）細菌裂解動力學監(jiān)測，主要得益于Octet®技術特點，浸入即讀的模式可以使檢測樣本不受限制，無流路的限制可以在長時間檢測時節(jié)省大量樣本!
除了以上優(yōu)勢Octet® BLI還具備以下特點：
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非標記Direct Binding是趨勢，不需要標記和信號放大，可以更好的保持反應物的活性
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快速測定親和力，提供結合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)更加定量化地表征分子互作
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無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）
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寫入了美國藥典，文章多，認可度廣
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萬金油技術，可以用與檢測小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子，還可以檢測細菌，噬菌體等
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操作簡便，耗材及維護成本低
-參考文獻-
[1] Needham, P., Page, R. C., & Yehl, K. (2024). Phage-layer interferometry: a companion diagnostic for phage therapy and a bacterial testing platform. Scientific reports, 14(1), 6026. https://doi.org/10.1038/s41598-024-55776-1