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陳老師最近不再只熱衷研究分子互作了。體外分子水平的研究要結(jié)合細(xì)胞學(xué)的體內(nèi)研究，才能得到更全面更真實(shí)的認(rèn)識(shí)。尤其是免疫學(xué)研究中的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞功能，細(xì)胞間的相互作用等，更是被越發(fā)看重。傳統(tǒng)的方法，比如某個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞固定染色通過(guò)顯微鏡拍照的方式觀察細(xì)胞的變化情況，或是用流式、ELISA、PCR等終點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，而且這還不是活細(xì)胞狀態(tài)。

如果能夠通過(guò)實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)反映出活細(xì)胞的狀態(tài)隨時(shí)間的變化，豈不是更好？

這不，陳老師最近好好地研究了一番賽多利斯生物分析的三劍客之一——Incucyte®實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)，直接把設(shè)備置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，不需要拿出培養(yǎng)箱觀察，即可對(duì)活細(xì)胞的行為進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、連續(xù)地監(jiān)測(cè)，可長(zhǎng)達(dá)數(shù)周，即可得到生長(zhǎng)曲線/IC50/EC50，又可生成圖片及視頻。這可太適合免疫學(xué)相關(guān)的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)了。

免疫學(xué)研究中常見(jiàn)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：

• 基礎(chǔ)研究：細(xì)胞增殖、免疫分型、免疫細(xì)胞激活與分化、細(xì)胞健康與凋亡等

• 細(xì)胞功能：免疫細(xì)胞殺傷、吞噬與清除作用、NETosis等

• 藥效評(píng)價(jià)：趨化/遷移、抗體內(nèi)化、病毒感染等

有了Incucyte®實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)，以上這些應(yīng)用與分析都信手拈來(lái)。

今天陳老師就先給大家介紹其中的五個(gè)應(yīng)用：

1. 細(xì)胞增殖及計(jì)數(shù)

2. 細(xì)胞鑒定和免疫分型

3. 細(xì)胞激活和分化

4. 細(xì)胞健康和凋亡

5. 免疫細(xì)胞殺傷（細(xì)胞溶解）

01

細(xì)胞增殖及計(jì)數(shù)

相比傳統(tǒng)“終點(diǎn)法“，Incucyte®利用實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析更高效地得到細(xì)胞增殖及計(jì)數(shù)結(jié)果（表1），并提供靈活、便捷的實(shí)驗(yàn)方案（圖1）。既可以直接進(jìn)行無(wú)標(biāo)記的細(xì)胞匯合度分析，又可通過(guò)專(zhuān)業(yè)的Incucyte® Cell-by-Cell Analysis軟件進(jìn)行無(wú)標(biāo)記的細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)面積尺寸、形狀及熒光強(qiáng)度等指標(biāo)在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)視野中的所有細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和計(jì)算，得到生長(zhǎng)曲線等數(shù)據(jù)結(jié)果。

表1. 終點(diǎn)法細(xì)胞增殖測(cè)定 vs 實(shí)時(shí)活細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞增殖測(cè)定

圖1. Incucyte®細(xì)胞增殖及計(jì)數(shù)分析
 

02

細(xì)胞鑒定和免疫分型

熒光標(biāo)記的CD抗體（Abs）被廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞識(shí)別和免疫分型，至少有15種人類(lèi)T細(xì)胞亞型被描述出來(lái)（例如，CD4+，CD8+等）。Incucyte®利用相同的原理，對(duì)標(biāo)記方法進(jìn)行改進(jìn)：

將抗CD抗體結(jié)合到同型匹配的帶有熒光標(biāo)簽的Fc區(qū)域靶向Fab片段，便可通過(guò)簡(jiǎn)單的一步混合來(lái)完成標(biāo)記。在檢測(cè)中使用一種非干擾性的背景熒光抑制染料，以改善488 nm的熒光信號(hào)，保護(hù)細(xì)胞的同時(shí)提供更靈活的分析方案。
 

03

細(xì)胞激活和分化

免疫細(xì)胞的分化和激活是免疫力和免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟。細(xì)胞通過(guò)受體信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行擴(kuò)增并產(chǎn)生功能效應(yīng)，最終導(dǎo)致基因表達(dá)、分化和表型變化。Incucyte®能夠更清晰、更深入地研究這個(gè)過(guò)程的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)性：

a. 通過(guò)無(wú)標(biāo)記或熒光標(biāo)記，對(duì)免疫細(xì)胞活化的形態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；

b. 使用cell-by-cell軟件模塊對(duì)細(xì)胞的圖像分割，進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)；
c. 使用Cytolight Rapid試劑監(jiān)測(cè)活化T細(xì)胞聚團(tuán)
 

04

細(xì)胞健康和凋亡

細(xì)胞健康和細(xì)胞凋亡的測(cè)量對(duì)于研究藥物、培養(yǎng)條件或基因改造對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)或活力的影響至關(guān)重要。 Incucyte®通過(guò)使用專(zhuān)為活細(xì)胞分析而優(yōu)化的熒光染料，提供了一種非干擾的、“即混即讀"分析方式對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡的時(shí)間過(guò)程以及它們與細(xì)胞增殖的關(guān)系的洞察。

Caspase 3/7染料在存在活性caspase的作用下發(fā)出熒光，可檢測(cè)長(zhǎng)期和短期效應(yīng)；Annexin V染料與細(xì)胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合檢測(cè)早期凋亡，細(xì)胞非通透性的DNA結(jié)合熒光探針則可用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性。該方法適用于貼壁細(xì)胞及非貼壁細(xì)胞，并且，無(wú)需將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出即可分析細(xì)胞健康和活力，保護(hù)細(xì)胞、節(jié)約時(shí)間、提高質(zhì)量。
 

05

免疫細(xì)胞殺傷（細(xì)胞溶解）

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTLs）、自然殺傷細(xì)胞（NK）和某些中性粒細(xì)胞能夠殺死被感染的或惡性細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞殺傷的檢測(cè)，可通過(guò)檢測(cè)垂死的目標(biāo)細(xì)胞中的釋放的Cr-51和細(xì)胞酶（如LDH）等來(lái)實(shí)現(xiàn)。但這些傳統(tǒng)方法存在諸多弊端，例如放射性。而檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于：

(1) 高背景信號(hào)；
(2) 難以辨別可能來(lái)自效應(yīng)（殺傷）細(xì)胞的污染信號(hào)；
(3) 如何判定并測(cè)量殺傷終點(diǎn)。

Incucyte®巧妙解決了以上難題。無(wú)需取出細(xì)胞、無(wú)需同位素或抗體標(biāo)記，免清洗。利用實(shí)時(shí)、連續(xù)的成像方式捕捉細(xì)胞隨時(shí)間的變化信息。其中可以用熒光蛋白（如RFP）標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞，當(dāng)它們被裂解時(shí)，監(jiān)測(cè)熒光的損失。另外也可直接采用annexin V或caspase 3/7測(cè)量目標(biāo)細(xì)胞的凋亡。這些方法對(duì)于表征檢查點(diǎn)抑制劑、CAR-T細(xì)胞、雙特異性抗體和其他基于免疫的療法的表型效應(yīng)非常有用。

既能不受培養(yǎng)環(huán)境限制進(jìn)行活細(xì)胞觀察，又能實(shí)時(shí)分析得到動(dòng)力學(xué)變化過(guò)程，就這么簡(jiǎn)單～陳老師今天先介紹到這里，還有5個(gè)應(yīng)用，請(qǐng)看下回分解～