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Vivaflow® 200：用于雜交瘤上清液濃縮的關(guān)鍵性樣本制備工具
摘要
本研究的重點是在進行親和色譜前使用Vivaflow® 200切向流膜包對多達3 L的鼠雜交瘤澄清上清液進行10倍濃縮。研究發(fā)現(xiàn)，同時使用兩塊Vivaflow® 200 (截留分子量 (MWCO) 30 kDa) 時，抗體回收率始終超過98%，濃縮速度約為20 – 25 mL/分。
簡介
采用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體在 (生物) 制藥行業(yè)、研究以及體外診斷 (IVD) 產(chǎn)品的生產(chǎn)中均有廣泛應(yīng)用。諸如蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光和ELISA等分析技術(shù)應(yīng)用廣泛。生產(chǎn)和加工單克隆抗體——特別是為IVD市場用戶生產(chǎn)需要一些保證的措施，如實施ISO 9001質(zhì)量體系以及采用的技術(shù)。
抗體生產(chǎn)中一個*的步驟就是使用超濾和微濾膜進行過濾 (1, 2)。攪拌加壓過濾曾是zui常用的實驗室濃縮方法，濃縮體積不到500 mL。以往的常見問題包括速度慢、泡沫過多以及缺少死體積保留導(dǎo)致抗體大量丟失。這迫使生產(chǎn)科學(xué)家尋找實驗室規(guī)模的正切流動過濾 (TFF) 方法。
使用微濾或超濾膜進行TFF廣泛用于蛋白和抗體的澄清、濃縮或緩沖液更換 (3, 4)。原料橫向流過濾膜 (正切)。在超濾模式下，低分子量分子通過濾膜濾出到濾液，而包含目標(biāo)抗體的原料則可在很短的時間里不斷濃縮到相對較高的蛋白濃度。
圖1：Vivaflow® 200正切流動膜包 (A) 及樣本容器 (B)、蠕動泵 (C) 和濾液收集瓶 (D)。
穩(wěn)定、可靠、可重復(fù)的樣本制備 (如蛋白和抗體濃縮/緩沖液更換) 是所有生物試劑下游加工過程的基礎(chǔ)步驟。在BioservUK，Vivaflow® 200循環(huán)流道膜包一直是shou選的濃縮工具，用于蛋白A或蛋白G制備色譜前雜交瘤澄清上清液原料的濃縮，大體積可達3 L。選擇超濾濃縮器時應(yīng)考慮以下參數(shù)：超濾膜的質(zhì)量、濃縮速度、抗體回收率、可重復(fù)使用性和成本效益。
在本文中，我們介紹了在BioservUK使用切向流動工藝對不同鼠IgG單克隆抗體亞類進行濃縮的情況。
材料和方法
圖2：在BioservUK對3 L雜交瘤原料進行下游加工的工作流程。
上清液來自雜交瘤細胞，后者由鼠B淋巴細胞和Sp2.0小鼠骨髓瘤細胞系融合而成，并進行轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。雜交瘤細胞常規(guī)培養(yǎng)在添加了歐盟批準(zhǔn)的10%胎牛血清 (Gibco貨號：10270-106) 的RPMI 1640培養(yǎng)基 (Gibco貨號：21875) 中。將一種原料在4至8°C下以8,000 g的離心力離心10分鐘，進行澄清。用2 L水預(yù)先清洗VF200，以去除儲存緩沖液。預(yù)先清洗過程中檢查Vivaflow® 200的完整性，時間在1分鐘以上，確保濾液流速> 55 mL/分鐘。
然后用兩個并行連接的Vivaflow® 200 (30 kDa MWCO，PES，Sartorius貨號：VF20P2) 和15號泵頭將上清液濃縮10倍 (圖1)。細胞培養(yǎng)液中抗體濃度通常約為30 mg/L。經(jīng)過Vivaflow® 200處理后抗體濃度一般約為300 mg/L (10倍濃縮)。
Vivaflow® 200濃縮器大流速以3個大氣壓限值指示。抗體濃縮后，將膜包用2 L水清洗，然后在再循環(huán)模式下用500 ml 0.5 M NaOH和1%次氯酸鈉溶液原位清洗 (CiP) 40分鐘。隨后用2 L水沖洗膜包，后加入200 ml 20%乙醇，在2– 8°C下儲存。將300 mL濃縮液在3,500 g下離心10分鐘，進一步去除顆粒物，然后用500 ml Sartolab RF真空濾器 (Sartorius貨號：180C2-E) 進行0.22 μm過濾，之后進行蛋白G HiFliQ 5 mL柱純化 (蛋白Ark貨號：HiFlIQ5-PG-5)。
結(jié)果
我們所有1– 3 L樣本濃縮步驟的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 (SOP) 中均包含Vivaflow® 200。該儀器使用極其簡便，濃縮速度約為20 – 25 mL/分時抗體回收率始終> 98%。重要的是，不可回收的滯留體積不到1 ml，十分理想，即使清洗步驟中壓力指示燈亮起也不影響回收率。整套獨立式系統(tǒng)可方便地與Masterflex Easy-Load蠕動泵頭連接和斷開，能夠儲存在冰箱中，隨時重復(fù)使用，無需手動調(diào)節(jié)。該系統(tǒng)無需手工操作，干凈清爽。
我們每20分鐘監(jiān)測一次流速，方法是在蠕動泵恒定速度下測定濾液體積。相應(yīng)的Masterflex L/S Economy Drive蠕動泵設(shè)置為3。圖4顯示了通常的流速，在20–25 mL/分范圍內(nèi)。將3 L樣本濃縮10倍一般需要2小時。
在BioservUK，我們建立了Vivaflow® 系統(tǒng)，適用于不同的免疫球蛋白G (IgG) 亞類。所有鼠IgG亞類 (IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3) 的回收率均超過98%。每完成3L樣本制備就進行一次原位清洗。各個Vivaflow® 200膜包僅用于一種特定的IgG亞類。我們的SOP允許每個膜包的大產(chǎn)量為50 L。
結(jié)論
Vivaflow® 200正切流動膜包使用簡便、流速快、成本低、通量高，且具有廣泛的化學(xué)相容性和總體耐用性，因此，我們圍繞該過濾濃縮步驟進行了1– 3 L雜交瘤培養(yǎng)液的下游加工。而在攪拌加壓過濾裝置中，使用的水平薄膜盤導(dǎo)致免疫球蛋白G在膜表面結(jié)塊，從而使得流速顯著降低，IgG損失可達40%。
我們得出的結(jié)論是，Vivaflow® 200是一款*的實驗室規(guī)模TFF耗材，研究表明這些橫向流動膜包是一種*的工具，適用于各種亞類的單克隆IgG的濃縮。對于體積高達3 L的樣本而言，Vivaflow® 200仍是我們的shou選，它是一款單克隆抗體級的超濾濃縮器。
參考文獻
1. Kemken R et al (1997) Dynamic membrane filtration in
mammalian cell culture harvest. In: Carrondo MJT, Griffiths B,
Moreira JLP (eds) Animal Cell Technology. Springer, Dordrecht.
2. Bertera R, Steven H, Metcalfe M (1984) Development Studies
of crossflow filtration, The Chemical Engineer. 401: 10.
3. Velez D, Miller L, MacMillan JD (1989) Use of tangential
flow filtration in perfusion propagation of hybridoma cells
for production of monoclonal antibodies. Biotech & Bioeng,
33 (7): 938.
4. Van Reis R et al (1997) high performance tangential flow
filtration. Biotech & Bioeng, 56 (1): 71.
免責(zé)聲明
實驗和方法均已獨立完成，作者對本文全部內(nèi)容負責(zé)。