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前 言
在分子生物學實驗室中，DNA聚合酶是構建遺傳物質的“建筑師"，但大多數聚合酶依賴模板鏈進行精準復制。而Terminal Deoxynucleotidyl Transferase（TdT，末端脫氧核苷酸轉移酶）卻打破了這一規則。作為DNA聚合酶第十家族（Pol X）的成員，TdT具有不依賴模板的DNA合成能力，這一特性使得它在許多領域展現出巨大的應用潛力，例如作為分子生物學工具用于基因突變和載體構建、開發基于TdT的生物傳感器用于疾病和金屬含量檢測、在DNA微陣列領域進行基因表達分析和microRNA檢測、基于DNA的新一代信息存儲技術、酶法從頭合成DNA技術等。
本文將從TdT的生化特性、核心應用場景展開論述，探討末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)在分子生物學中的價值。
TdT的生化特性
無模板合成的“分子魔術師"
結構基礎與催化機制
TdT的催化核心由四個結構域組成，整體呈“右手"狀構象，與DNA聚合酶β（Pol β）的同源結構域高度相似。其活性中心包含兩個關鍵基序：ALLGW（T/S）GSR和TGGFRRG。前者通過“打開-關閉"構象轉變調節底物結合，后者則依賴精氨酸殘基穩定催化反應。雙金屬催化機制（通常為Mn2?或Co2?）是TdT的核心特征：金屬A（如Co2?）在底物結合階段暫時參與，金屬B（如Mg2?）則持續穩定催化中心。這種機制使TdT能高效識別含至少3個堿基的引物鏈，甚至對六乙二醇修飾的短鏈也具有活性。
圖1.TdT催化的反應
底物兼容性與反應條件
TdT的底物譜廣泛，涵蓋單鏈DNA（ssDNA）、雙鏈DNA（dsDNA）及部分RNA分子。實驗顯示，其對平末端DNA的催化效率顯著高于模板依賴型聚合酶，且對修飾核苷酸（如ddNTP、DIG-dUTP）具有高度兼容性。典型反應條件為37℃、60分鐘，1個活性單位定義為在上述條件下催化1 nmol dNTP摻入DNA的酶量。值得注意的是，高濃度銨根離子、氯離子及EDTA會抑制其活性，而Co2?的添加可提升對平末端的催化效率達3倍以上。
生理功能與免疫應答關聯
TdT作為誘變因子參與免疫球蛋白和T細胞受體蛋白基因多樣性形成，該過程發生在表達TdT的前淋巴細胞，在這些細胞里TdT隨機添加大約1-10個核苷酸到基因編碼區末端，從而增加了免疫組庫的多樣性(圖2)。值得注意的是，TdT在V(D)J重組中發揮作用需要DNA修復途徑的其他酶(如KU80和XRCC4)協助，然后被招募到V(D)J重組復合體。研究表明，敲除TdT基因的小鼠體內TCR庫多樣性降低70%，驗證了其在免疫應答中的核心作用。
圖2 .TdT的生物學功能
TdT的核心應用場景
從基礎研究到工業應用
基因工程與載體構建
TdT在基因工程中的經典應用是“同聚物加尾法"。通過在載體DNA的3'末端添加dATP或dTTP尾鏈，與互補的外源DNA片段退火連接，可高效構建重組質粒。例如，在cDNA文庫構建中，TdT介導的加尾反應使mRNA的3'末端獲得poly（A）尾鏈，從而與含poly（T）的載體特異性結合，提升克隆效率。此外，在RACE（快速擴增cDNA末端）技術中，TdT通過添加隨機核苷酸尾鏈，為后續PCR提供引物結合位點，實現全長cDNA的捕獲。
圖3 .使用TdT合成DNA
TUNEL技術
細胞凋亡發生時，相關DNA內切酶會被激活，從而切斷核小體間的DNA。在細胞凋亡晚期，DNA會被降解為180-200 bp的片段。 TdT介導的dUTP末端標記法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）是在TdT的催化下將熒光素標記的dUTP（fluorescein-dUTP）與斷裂DNA暴露的3'-OH聚合，延伸后的DNA可通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測。臨床研究顯示，TUNEL在急性淋巴細胞白血病（ALL）診斷中具有特異性。ALL患者骨髓樣本的TdT陽性率達95%，而成熟淋巴細胞呈陰性，為疾病分型和預后評估提供關鍵依據。
圖4 .TdT標記細胞凋亡
DNA甲基化測序的“接頭工程師"
在全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）中，TdT通過添加同聚物尾鏈實現ssDNA與接頭的連接。具體流程為：
重亞硫酸鹽（Bisulfite）處理DNA，使未甲基化修飾的胞嘧啶C轉化為尿嘧啶U，變性為ssDNA。
3′接頭連接，TdT末端轉移酶參與目的DNA 3′端添加接頭的過程，催化ssDNA的3′羥基端加上同聚物尾巴（示意圖中橙色曲線部分），從而在連接酶的作用下與接頭進行連接。
DNA二鏈合成，5′接頭連接。
PCR擴增獲取含有完整接頭序列的上機文庫。
圖5. DNA甲基化建庫流程
酶促法DNA合成的“基石"
TdT在DNA從頭合成技術中占據核心地位。基于其非模板依賴特性，研究者開發出兩種策略：
Type I策略：將dNTP的堿基部分通過連接物（linker）與TdT共價連接，形成TdT-dNTP耦合物。耦合物催化引物DNA延伸一個堿基后，產物DNA仍與TdT共價結合，阻礙后續添加。通過物理、化學或生物方法切斷連接物，釋放產物DNA，進入下一循環。
Type II策略：使用3'-OH端帶有可逆保護基團的dNTP（如RTdNTPs）。TdT催化RTdNTP添加至引物DNA后，產物DNA因3'-端被保護而無法繼續延伸。通過脫保護步驟去除保護基團，恢復3'-OH，進入下一循環。
DNA微陣列技術
TdT酶（末端脫氧核苷酸轉移酶）在DNA微陣列技術中主要應用于單鏈DNA文庫構建及探針標記優化，通過其非模板依賴的末端延伸特性提升雜交效率與信號強度，同時助力DNA序列的定向修飾，為微陣列檢測的靈敏度和特異性提供關鍵支持。
TdT作為分子生物學工具中的“非模板革命者"，其應用已從基因工程基礎技術延伸至臨床診斷和合成生物學前沿。隨著酶工程改造技術的進步，TdT的穩定性、底物兼容性和催化效率將持續優化，為DNA測序、疾病標志物開發及DNA存儲技術提供更強動力。未來，TdT有望成為連接基礎研究與臨床轉化的關鍵橋梁，推動生命科學進入精準調控的新紀元。
現在翌圣重磅推出具有低殘留、高純度的特點的TdT末端轉移酶，高效進行DNA末端的同聚物加尾。適用于各種應用場景。
性能展示
無切口酶殘留
切口酶殘留結果：跑膠結果顯示兩批次TdT末端轉移酶與陰性對照（C）一致，顯示無切口酶殘留。
無核酸外切酶殘留
核酸外切酶殘留結果：跑膠結果顯示兩批次TdT末端轉移酶與陰性對照（C）一致，顯示無核酸外切酶酶殘留。
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參考文獻：
Chengjie Zhang, et,al.Terminal deoxynucleotidyl transferase: Properties and applications,Engineering Microbiology , Volume 5, Issue 1 , 2025,100179, ISSN 2667-3703.
#Terminal Deoxynucleotidyl Transferase #TdT #末端脫氧核苷酸轉移酶
