聯系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級會員·13年
- 聯系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區天雄路166弄1號3樓
- 網址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機商鋪
不知各位小伙伴在做熒光定量qPCR實驗的時候有沒有遇到過以下這些情況？
主峰左邊有雜峰，疑似引物二聚體
主峰右邊有雜峰，疑似非特異擴增
基因表達無差異
每當出現這些情況，就意味著可能要重新做實驗。為確保下一次實驗不出錯，了解其原因十分重要，可能是體系污染導致，也可能是擴增特異性不足導致。在這里小翌教大家從引物設計的角度提升擴增特異性！
在進行qPCR引物設計時，相信有不少小伙伴聽過類似“跨內含子設計"的要求，那么，要跨內含子設計是啥？為什么要跨內含子設計呢？
以人基因組來說，平均每個基因有8.8個外顯子和7.8個內含子，80%的外顯子長度小于200bp，少于10%的內含子長度在1100bp以上，不到0.01%的內含子長度小于20bp。
我們在進行一些熒光定量qPCR實驗之前，需要提取RNA和反轉錄合成cDNA，cDNA作為模板用于分析基因表達情況。故在DNA序列上設計引物需避開內含子序列區域，選用外顯子區域序列用于引物設計。看到這，有小伙伴會有疑問，那為啥不叫“外顯子設計"或者“去內含子設計"呢，為啥要稱為“跨內含子設計"？
是的，引物還需要跨內含子，在設計引物時需要讓一端引物或者兩端引物跨越內含子，否則熒光定量qPCR的熔解曲線可能出現雙峰或者多峰。
在單個外顯子上進行上下游引物設計
在這種情況下，由于產物序列一致且大小一致，從熔解曲線上難以分辨，看上去都是單一的熔解峰，但是在進行數據分析時，往往會有一種感覺，就是基因表達無差異或者差異結果不穩定。
在兩個外顯子上進行上下游引物設計
在這種情況下，產物差距就比較大了，基因組DNA(gDNA)擴增產物較cDNA擴增產物更長，熔解溫度(Tm值)更大，在熔解曲線上表現出來則是主峰右側的雜峰。當然還有一種情況，當以gDNA為模板所需擴增的片段很長，難以擴增，最終產物相對單一，熔解曲線峰也是相對單一的。
建議的上下游引物設計方式
引物跨內含子設計后，對于引物序列本身還有什么要求呢？接下來小翌給大家分享引物設計原則~
qPCR引物設計原則
參考項 | 標準參考 |
產物長度 | 80-300bp |
引物長度 | 17-25 base |
GC含量 | 40-60%（45-55%為最佳） |
Tm值 | 上游引物F和下游引物R的Tm值不能相差太大，最好不超過1℃。 |
引物序列 | A、T、C、G整體分布盡量均勻。避開T/C或A/G的連續結構。 |
3末端序列 | 避免GC rich或AT rich。3端堿基最好為G或C，盡量避免末端堿基為T。 |
互補序列 | 避開引物內部或兩條引物之間有3個堿基以上的互補序列。 兩條引物間的3末端避開有2個堿基以上的互補序列。 |
特異性 | 使用BLAST檢索確認引物的特異性。 |
產物長度
產物擴增長度為80-200bp，必要時可選擇加長。通常擴增效率隨著擴增產物長度增大而減小。但是不能太短，否則難以區分是引物二聚體還是擴增產物。
末端序列
引物末端最好是G或C，因為GC堿基之間是三個氫鍵連接，能夠保證引物和模板連接的穩定性。
互補序列
引物3端通常是DNA聚合酶延伸的起點，如果兩條引物在3端互補性過高，則更易形成引物二聚體，從而降低PCR的擴增效率和特異性。
若引物自身的互補性高，則會發生自身退火，形成發夾結構，或者兩條一樣的引物形成二聚體，從而降低PCR的擴增效率和特異性。
聊完了原則上qPCR引物如何設計之后，接下來讓我們進入小伙伴們最為關注的實戰操作。在這里小翌給大家介紹三種方式設計qPCR引物！
Primer3Plus
Load server settings 選擇qPCR，后上傳設計引物的序列或粘貼需要設計引物的序列。按照自己的引物設計需求，選擇使用排除的區域Excluded Regions、目的擴增區域Targets和包含區域Included Region。
點擊General Settings按照熒光定量qPCR引物設計原則進行相關參數設置，例如擴增產物長度Primer Size Ranges、引物長度Primer Size、Tm值Primer Tm、GC含量Primer GC%。完成相關參數設置后，點擊右上方綠色按鈕Pick Primers，即可獲得相關引物。
獲得相關引物序列后，到NCBI blast 進行引物特異性驗證。
Primerbank
它是哈佛大學的一個PCR引物數據庫，包含 306,800 多種引物，涵蓋大多數已知的人類和小鼠基因。通過 Real Time PCR 測試了與 27681 個小鼠基因相對應的 26855 對引物，然后對 PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳和測序。根據瓊脂糖凝膠電泳結果，設計成功率為 82.6%（22187 對引物）。
首先在NCBI上找到目的基因的gene ID，例如，這里選用老鼠基因IL6的gene ID 16193。
Search by選擇 NCBI Gene ID，Species選擇Mouse，輸入16193，點擊Submit，即可獲得相關引物。
相關引物還有已驗證的可視化結果。
NCBI
打開NCBI，選擇“Gene"，輸入想要檢測的基因名稱，我們以人基因“ALAD"為例。
會出現很多搜索結果，我們選擇需要的種屬來源，即“human"，如果你知道Gene ID（每個基因有且只有一個特定的ID，類似于人的），也可以根據Gene ID來選擇。這里我們選擇搜索結果中的第一個。
點開之后，會出現很長的頁面，耐心往下拉，找到“mRNA and Protein（s）"欄下的NM編號，不同的NM編號，代表不同的isoform。選擇想要檢測的那一個。
確定NM號點擊后，可以看到這個isoform的一些基本信息。
例如：gene代表基因長度3129bp，CDS代表編碼蛋白區域149-1141bp。
以及此基因的序列，如下圖所示。此序列就是設計引物時對應的模板。
了解完我們所需的isoform后，我們可以點擊右側的“Pick Primers"，就能直接進入Primer-BLAST的頁面進行引物設計了。
在彈出來的界面里粘貼模板序列或者輸入基因序列號。另外需要設置“上下游引物位置"和“擴增子長度"。最主要的設置就是這兩點了，另外還有“物種名稱"、“數據庫"等其他選項可以設置。
設置好之后，點擊頁面左下角的“Get Primers"。
多對引物，選擇合適的引物即可。
獲得相關引物序列后，到NCBI blast進行引物特異性驗證。
新品預告
翌圣生物基因研究完整解決方案
產品特別推薦
方法 | 分類 | 產品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
免氯仿升級版 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent(Tcm Free) | 19202ES | |
動物組織/細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
反轉錄試劑 | 5 min一步gDNA去除&反轉錄預混液(下游應用qPCR) | Hifair® AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix for qPCR | 11151ES |
5 min快速反轉，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR) | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149/11150ES | |
高鏈cDNA合成預混液，含gDNA去除(下游應用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
qPCR染料法 | 高特異高熒光值定量預混液(染料法) | Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix | 11185ES |
高靈敏通用型定量預混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES | |
定量預混液 (染料法)，已發文章累計IF達到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES |
