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2023年11月16日，Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics共同宣布基因編輯療法產品CASGEVY™（Exagaglogene autotemcel）獲英國藥品監管機構MHRA有條件批準上市，用于治療治療鐮狀細胞?。⊿CD）和輸血依賴性β-地中海貧血（TDT），是獲批上市的CRISPR基因編輯藥物，12月8日，美國食品和藥物管理局（FDA）也批準了該基因編輯治療藥物。這是基因編輯治療里程碑事件，代表著一項重大的科學進步可以讓數以萬計的患者受益。
圖1. CASGEVY™治療流程（Source：CRISPR Therapeutics）
CRISPR基因編輯療法
自2012年亮相以來，CRISPR技術已在基因功能研究、藥物靶點篩選、遺傳疾病治療、癌癥研究以及作物育種等多個領域取得突破性成果。其工作機制如下：
Cas蛋白（如常用的Cas9）在gRNA的引導下定位到目標DNA序列，隨后Cas9與DNA結合并切割其雙鏈，產生一個雙鏈斷裂（DSB）。細胞為了修復這一斷裂，將啟動自身的修復機制，如非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復（HDR）。通過這些修復過程，可以在目標DNA中引入特定的序列。
目前CRISPR技術能精確度對DNA進行修改，包括添加、刪除或替換特定基因片段，這一進步不僅使基因修復更加便捷和精準，也為基因治療指明了新的發展方向?；贑RISPR技術的基因治療主要分為體外和體內兩種形式，下面將為大家詳細介紹。
圖2. 體外與體內基因編輯療法[1]
體外基因編輯療法
體外CRISPR基因編輯療法主要包括從患者身上收集細胞、在體外進行進行CRISPR基因編輯、將編輯后的細胞移植回患者體內等流程，上述介紹的CASGEVY™便是典型的體外CRISPR基因編輯療法。除了直接利用CRISPR技術糾正導致癌癥的基因突變外，該技術在癌癥治療領域的另一關鍵應用是免疫細胞的工程化改造，如創建嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）、通用型CAR-T（UCAR-T）等抗癌免疫療法。
CAR-T療法是通過改造患者自體T細胞，使T細胞表面表達針對特定癌癥抗原的嵌合抗原受體（CAR），通過CAR特異性識別體內腫瘤細胞，并釋放大量的多種效應因子，高效地殺滅腫瘤細胞。然而，CAR-T療法在實際應用中仍面臨一些挑戰，包括較長的制備周期、自體T細胞質量的不穩定性以及相對較高的治療成本，這些因素限制了其更廣泛的應用。
圖3. CAR-T療法流程圖[2]
為了突破傳統CAR-T療法的限制，UCAR-T療法，即通用型CAR-T或異體CAR-T應運而生。這種療法使用健康捐獻者的T細胞作為原料，通過病毒載體等技術將CAR基因導入T細胞，并運用基因編輯技術去除T細胞表面的TCR、HLA或CD52等分子，以預防供體T細胞引發的移植物抗宿主?。℅vHD）并降低患者對異體細胞的排異反應（HvGR）。經過這一系列精細的改造和擴增過程，UCAR-T細胞被制備成可用于治療患者的成熟產品。
圖4. UCAR-T療法流程[3]
UCAR-T療法流程：
供者篩選
選擇健康供者進行T細胞的采集。
CAR的引入
利用病毒載體或非病毒方法將CAR基因轉入T細胞，使其能夠特異性識別腫瘤細胞表面的抗原。
基因編輯
使用CRISPR/Cas、TALENs或ZFNs等基因編輯技術，敲除T細胞表面的TCR、HLA或其他可能導致免疫排斥的分子，以降低異體反應。
體外擴增
在實驗室條件下對改造后的T細胞進行大量擴增，以獲得足夠的細胞數量用于治療。
質量控制
對擴增后的UCAR-T細胞進行嚴格的質量檢測，包括細胞活性、純度、無菌性等。
患者篩選和準備
確定患者是否適合接受UCAR-T治療，并進行一些預處理，以減少宿主對UCAR-T的排斥。
細胞輸注
將UCAR-T細胞通過靜脈輸注到患者體內。
CRISPR基因編輯的體外療法涉及從患者體內提取細胞，在實驗室環境中進行基因修改，然后將經過編輯的細胞重新輸回患者等過程。這種方法適用于某些關鍵類型的細胞，如造血干細胞（HSC），但并不適用于所有種類的細胞。另一種基因編輯療法是直接在體內進行的基因編輯，無需細胞提取和體外操作的步驟，可直接在患者的體內進行基因編輯。這種方法易于批量生產，給藥方式簡單，能顯著降低治療成本，還能為難以進行細胞提取或體外培養的疾病提供治療可能。
體內CRISPR基因編輯療法
體內基因編輯療法主要通過將基因編輯工具直接輸送至患者體內，在體內環境中對引發疾病的特定基因進行精確且有效的修改。目前已用于體內基因編輯治療的基因編輯工具有3類：核酸酶（Nucleases）、堿基編輯器（Base editors）及先導編輯器（Prime editors）。
圖5. 體內基因編輯療法原理圖[4]
在哺乳動物細胞中，通常利用核酸酶在基因組DNA的特定位置引入DSB實現有效的基因編輯，其中，CRISPR-Cas核酸酶系統因其高效性和精確性而成為創建定向DSB廣泛的應用工具。CRISPR-Cas核酸酶系統體內基因編輯流程如下：
gRNA設計及合成
設計特異性的導向RNA（gRNA）以靶向特定的DNA序列。
Cas蛋白遞送形式選擇
選擇合適的基因編輯形式，如質粒DNA（pDNA）、mRNA或Cas核糖核蛋白（RNP）。
遞送系統的選擇與優化
選擇合適的遞送系統，如腺相關病毒（AAV）、脂質納米顆粒（LNP）、病毒樣顆粒（VLP）等。
體內送達
將基因編輯復合體通過靜脈注射、局部注射或其他方式遞送到患者體內。
基因編輯
在目標細胞內，gRNA引導Cas蛋白識別并結合到目標DNA序列。Cas蛋白在目標位點造成DNA雙鏈斷裂（DSB）。
DNA修復
細胞通過自身的DNA修復機制，對斷裂的DNA進行修復。
監測與評估
監測基因編輯效果，評估脫靶效應和治療效果。通過生物標志物和臨床指標評估安全性和有效性。
圖6. 核酸酶作用原理圖[1]
來源于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9蛋白是目前最為常用的一種Cas蛋白，然而，由于SpCas9潛在的脫靶效應和尺寸限制等問題，研究人員持續探索其他類型的Cas蛋白，如Cas12和Cas13，以期找到更小、更精確的Cas蛋白。同時，通過蛋白質工程技術對Cas蛋白進行改造也是當前研究的重點之一。這些改造旨在提高基因編輯的效率、減少脫靶率并優化編輯窗口，從而進一步擴展CRISPR技術在基因治療等領域的應用潛力。
目前CRISPR基因編輯技術仍處于高速發展階段，整個行業尚未成熟，隨著技術的不斷進步，預計會有更多的遞送技術得到改進，新的傳遞工具也將誕生，從而進一步提高治療的安全性和效果。體外CRISPR基因編輯療法已上市，相信體內療法也會在不久的將來問世。
基因編輯相關產品
編輯類型 | 產品分類 | 產品名稱 | 產品貨號 |
體外編輯（研究級） | Cas9蛋白 | Cas9 Nuclease | 14701ES |
Cas12a蛋白 | ArCas12a Nuclease | 14702ES | |
Cas12b蛋白 | AapCas12b Nuclease | 14808ES | |
sgRNA合成 | Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit | 11355ES | |
表達鑒定 | Cas9(CRISPR Associated Protein 9) ELISA Kit | 99401ES | |
體內編輯 （GMP級） | 內切酶 | BspQI GMP-grade (10 U/μL) | 10664ES |
Bsa I GMP-grade (20 U/μL) | 10661ES | ||
T7 RNA Polymerase | T7 RNA Polymerase GMP-grade (50 U/μL) | 10624ES | |
無機焦磷酸酶 | Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade | 10620ES | |
RNase抑制劑 | Murine RNase inhibitor GMP-grade | 10621ES | |
牛痘病毒加帽酶 | mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade | 10614ES | |
Cap2氧甲基轉移酶 | mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase GMP-grade | 10612ES |
參考文獻：
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