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研究背景
真核細胞在遭受外界不利條件的脅迫時，細胞穩態往往被擾亂，導致細胞功能的正常運行乃至存活都面臨挑戰。細胞中的內質網作為蛋白質合成、折疊、加工和運輸的重要場所，外部刺激導致的蛋白質穩態失衡會引起未折疊或錯誤折疊蛋白質在內質網中的積累，引發內質網應激（ER stress）。在內質網（ER）應激時，內質網膜跨膜蛋白激酶/內切核酸酶肌醇需要酶1（IRE1）的激活是未折疊蛋白響應通路（UPR）的一個關鍵信號，激活的肌醇需要酶1（IRE1）可以形成大型聚集物/聚焦簇，但是其確切的結構特點、動態特征、功能特性迄今為止仍然大部分不明。
研究目的
為研究細胞抗逆應激的生物學機制，武漢大學生命科學學院劉勇教授課題組于2024年5月8日在國際學術期刊《Nature Cell Biology》（IF：21.3）上發表題為“Mammalian IRE1α dynamically and functionally coalesces with stress granules"的文章。
文章發現IRE1α能夠在不同應激條件下與應激顆粒（SG）通過相分離形成共聚集簇，提示IRE1α與應激顆粒的協同共聚能夠富集IRE1α-XBP1通路中的關鍵組分，為IRE1α蛋白機器提供了一個更為高效的運行平臺，從而賦予細胞更強的應激處理能力（下圖1）。
圖1. 哺乳動物細胞中IRE1α-SG共聚集簇的功能機制示意圖
研究創新點
揭示未折疊蛋白響應分子IRE1α與應激顆粒共聚集的動態特征與功能機制，這些發現為理解細胞如何在內質網應激下調節IRE1α聚集和應激顆粒形成提供了重要的視角，可能對研究細胞應激反應機制和相關疾病治療具有重要意義。
研究要點
肌醇需要酶1（IRE1）是位于內質網上的跨膜蛋白，IRE1是從酵母到哺乳動物保存的最古老的內質網應激傳感器，具有一個N端內質網管結構域(LD)，用于檢測未折疊/錯誤折疊的蛋白質負載，一個跨膜段，一個細胞質連接體和一個C端蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶和核糖核酸內切酶(RNase)結構域，通過激活其胞內段蛋白激酶和核糖核酸內切酶的雙重活性，起始并控制著未折疊蛋白響應中最為保守的一條信號通路。
在內質網應激條件下，哺乳動物細胞中IRE1α通過剪切編碼X盒結合蛋白1（XBP1）mRNA底物產生剪接形式的XBP1s （spliced XBP1）mRNA并翻譯出具有轉錄活性的XBP1s轉錄因子，以此調控下游應激響應蛋白的表達。大量研究已經證實IRE1α-XBP1通路在細胞命運決定以及包括免疫、代謝和惡性腫瘤在內的許多生物學過程中起關鍵作用。
研究通過免疫熒光檢測、活細胞成像、光遺傳學、免疫共沉淀及細胞組分分離等實驗發現，在哺乳動物細胞中，IRE1α聚集體的形成是與應激顆粒的組裝相耦合的內質網膜結合相分離事件，位于內質網的IRE1α聚集簇可以動態地與應激顆粒結合，并與應激顆粒的組裝同步偶聯，形成IRE1α-SG共聚集簇。
IRE1α的細胞質連接部分（連接內質網跨膜結構域和激酶結構域的連接區（Linker））具有固有無序區域（IDR），這是與應激顆粒共凝聚的關鍵所在。
應激顆粒組裝的破壞會阻止IRE1α聚集簇的形成，并影響XBP1 mRNA的剪接加工。
在內質網應激狀況下，IRE1α-SG聚集簇能夠富集IRE1α-XBP1信號通路的關鍵組分：RtcB連接酶和XBP1 mRNA底物。
IRE1α-SG聚集簇在時空上的動態特征，表明通過相分離形成的IRE1α-SG聚集簇能夠產生更為高效的IRE1α內切酶加工機器，從而增強細胞應對內質網應激的能力，維護細胞的功能穩態。
研究方法
IRE1α聚集簇在不同應力下與應激顆粒（SG）共定位
為了探討不同應激條件下，IRE1α聚集與應激顆粒形成之間的關系，使用化學內質網應激劑thapsigargin (Tg)（56306ES）處理哺乳動物細胞，來測試內源性IRE1α是否能在細胞中形成大的聚集體。使用共聚焦顯微鏡分析和免疫熒光染色，發現在ER應激的HeLa細胞中，IRE1α形成了大量0.5–5 μm的大聚集體/簇或焦點。結果顯示，含有IRE1α聚集簇的細胞百分比隨著Tg（56306ES）處理劑量的增加和時間的延長而增加，且在Tg處理后3小時達到高峰。這一發現表明IRE1α聚集簇的形成具有劑量響應性和時間依賴性。（見下圖2）
圖2. IRE1α簇與SG共定位以響應不同類型的應力
通過對應激顆粒骨架蛋白G3BP1進行共染色，發現應激顆粒的形成也非常強烈，并且與IRE1α聚集體幾乎全共定位。這表明在ER應激條件下，IRE1α聚集簇和應激顆粒之間存在著密切的空間關聯。（下圖3）
圖3. 共焦顯微鏡圖像
由于應激顆粒可以由不同的應激條件誘導，探究IRE1α是否也能響應其他應激因子與應激顆粒共聚集。結果表明，與thapsigargin (Tg)誘導的ER應激相比，使用硫代（SA）和熱應激（HS）處理能更有效地誘導大型IRE1α聚集簇的形成。這些聚集簇主要與G3BP1陽性的應激顆粒共定位。（下圖4）
圖4. 內源性IRE1α在不同類型的應激反應中形成大簇
線性分析IRE1α/G3BP1雙陽性聚集體的結果也表明了這種共定位現象。同時，在使用TIA1（另一個SG支架標記）共染色時，也在HeLa細胞中檢測到共定位的IRE1α–SG聚集體的形成。（下圖5）
圖5. IRE1α蛋白與SG組分的增強結合
研究表明，大型IRE1α聚集體的組裝與SG形成有選擇性的關聯，這是一個普遍的、與細胞類型無關的事件，而不是特定于ER應激的現象。接下來探究生理相關性的應激條件，如缺氧和代謝紊亂對聚集體形成的影響。雖然，在暴露于缺氧條件（1% O2）的HeLa細胞中，沒有觀察到大型IRE1α聚集體或SGs的形成。但是，在葡萄糖剝奪條件下，檢測到了共定位的IRE1α–SG聚集體，特別是在存在糖酵解阻斷劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）（54104ES）的情況下，這種現象尤為強烈，而2-DG并不引起eIF2α的磷酸化。由于2-DG抑制己糖激酶，從而影響己糖生物合成途徑，可能會阻斷ER蛋白的糖基化，這些數據表明IRE1α–SG的共聚集也是對營養/代謝應激的響應行為，可能源于ER蛋白折疊的擾動。（下圖6）
圖6. 缺氧和葡萄糖剝奪反應中IRE1α-SG簇形成的分析
IRE1α在ER處動態地與SG相連
接下來，團隊研究了應激HeLa細胞中IRE1α–SG簇的動力學和結構特征。在消除應激源后，可見IRE1α簇與SG協同減少。表明在應激恢復過程中，IRE1α聚集簇也與SG分解動態耦合。此外，使用增強型綠色熒光蛋白（EGFP）-Sec61β對ER網絡進行可視化顯示，利用二聚化依賴性熒光蛋白（ddFP）報告系統監測來自不同二聚化伴侶的熒光縮合信號，可見IRE1α/G3BP1雙陽性簇圍繞ER小管分布在整個細胞質中，IRE1α與核心SG支架蛋白的結構相互作用。（下圖7）
圖7. ER處IRE1α-SG團簇的動力學特征
COS7細胞的共聚焦顯微鏡圖像顯示，內質網應激誘導IRE1α-YFP與G3BP1/TIA1陽性SG的各種合并或并置聚集，其中一些反映了內質網處縮合物的不對稱分層結構。此外，在Tg和SA應激的細胞中，IRE1α/G3BP1聚集與IRE1α/TIA1聚集基本重疊，表明IRE1α與SG支架蛋白的復雜相互作用。實驗還觀察到聚結的IRE1α/G3BP1顆粒在Tg誘導的內質網應激過程中在ERin細胞處積極進行分裂和融合。這些結果表明，IRE1α聚集簇作為其整體伙伴與SG動態相連。（見下圖8）
圖8. 應力恢復過程中聚結IRE1α-SG團簇的協同還原
IRE1α的胞質連接子對與SGs的共聚集至關重要
考慮到SGs的胞質位置，我們使用其細胞質部分的缺失突變體確定了IRE1α與SGs相關的結構域結構。共免疫沉淀分析表明，在內質網應激下，IRE1α_ΔL蛋白的胞漿連接區缺失顯著削弱了其與SG蛋白的結合，而IRE1α-ΔR或IRE1α/ΔKR蛋白的胞質連接區缺失則顯著削弱了與SG蛋白之間的結合。研究表明，IRE1α的胞質連接子對其與SGs的結合至關重要。IRE1α的細胞質連接內質網跨膜結構域和激酶結構域的連接區（Linker））具有固有無序區域（IDR），這是推進其與應激顆粒共聚集的關鍵結構域。
SG聚結控制IRE1α的聚集和活性
接下來，研究探討IRE1α聚集是否會影響SG的形成，反之亦然。在不同的應力下，IRE1α的損失不影響IRE1α耗盡的HeLa細胞中SG的形成。此外，對G3BP1顆粒與IRE1α缺陷細胞中的ER膜結合的鈣結合蛋白（CalN）的相關性的ddFP報告子分析顯示，在ER應激下，SG–ER接觸與對照細胞相當。因此，IRE1α聚集不會嚴重影響SG形成的細胞能力，也不是將SG與ER微管連接的關鍵因素，但SG組裝的破壞會阻止IRE1α聚集簇的形成，并對XBP1 mRNA的剪接加工效率造成影響。
SG凝聚促成了更高效的IRE1α加工機器
最后研究探討了較高IRE1α RNA酶輸出的分子基礎，即XBP1 mRNA剪接，這是由內質網應激下形成的大IRE1α-SG簇引起的。實驗通過檢測IRE1α-相鄰蛋白質中IRE1α–XBP1軸的關鍵成分的變化，發現在內質網應激狀況下，IRE1α-SG聚集簇能夠富集IRE1α-XBP1信號途徑中的關鍵成分：RtcB連接酶和XBP1 mRNA底物。相分離形成的IRE1α-SG聚集簇能夠產生更為高效的應激處理工作站——IRE1α內切酶加工站，增強細胞的應激能力，高效維護細胞穩態。
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在該研究中，研究團隊使用了翌圣生物G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳霉素（60220ES）進行細胞轉染和篩選：
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