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CRISPR技術(shù)自2012年問世至今，憑借其的性能，迅速在基因編輯領(lǐng)域嶄露頭角，成為了基因編輯工具。這一技術(shù)的誕生，為基因功能研究、藥物靶點篩選、遺傳疾病治療、癌癥研究以及作物育種等多個領(lǐng)域帶來了突破性的進展。因其顯著的成果，科學(xué)家Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna榮獲了2020年諾貝爾化學(xué)獎。
圖1. 2020年諾貝爾化學(xué)獎得主[1]
CRISPR/Cas系統(tǒng)的核心依賴于兩個主要組件：一是具有核酸切割能力的Cas蛋白；二是特異性指導(dǎo)Cas蛋白精確剪切的向?qū)NA（gRNA）。因此，在基因編輯過程中，除了選擇合適的高效Cas蛋白外，精心構(gòu)建高效且具有針對性的sgRNA同樣至關(guān)重要。gRNA由一個tracrRNA和至少一個crRNA組合構(gòu)成，Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna通過將tracrRNA和crRNA融合成一條單鏈——單鏈向?qū)NA（sgRNA），極大地簡化了sgRNA的生成和應(yīng)用步驟。通常所說的sgRNA設(shè)計實際上是指對其中的crRNA組成部分進行精確設(shè)計，以便挑選出適合的sgRNA。
圖2. sgRNA示意圖（以Cas9為例）
sgRNA的合成方式
sgRNA的合成方法主要分為體外轉(zhuǎn)錄（IVT）和化學(xué)合成兩種，其中，由于IVT方法具備操作靈活、成本效益高以及產(chǎn)出量大等優(yōu)勢，在實驗室環(huán)境中被廣泛采用。
經(jīng)過精心的設(shè)計與開發(fā)，翌圣生物推出了專門針對Cas9蛋白的sgRNA體外轉(zhuǎn)錄合成試劑盒——Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit（11355ES）。該試劑盒的應(yīng)用極為簡便，用戶只需設(shè)計一條特定的上游引物，并結(jié)合試劑盒提供的其他試劑，即可在短短4h內(nèi)合成20-100 μg高品質(zhì)的sgRNA。所產(chǎn)生的sgRNA具備高產(chǎn)量、高純度和高活性等優(yōu)勢，在基因編輯過程中能顯著提升編輯效率，并大幅降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生幾率，確保基因編輯工作以高效率和高準確性進行。
翌圣sgRNA合成試劑盒性能展示
高合成產(chǎn)量
單管反應(yīng)4h，sgRNA產(chǎn)量可達20-100 μg
sgRNA的濃度關(guān)系到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效果成敗，只有加入高濃度的sgRNA方能對基因的編輯起較好效果。翌圣的Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit可在單管反應(yīng)4h內(nèi)獲得20-100 μg的sgRNA，足以滿足基因編輯的需要。
圖3. 不同時間的sgRNA的合成量
適用范圍廣
不同種類的sgRNA均可獲得高產(chǎn)量
一個優(yōu)質(zhì)的sgRNA Synthesis Kit不僅應(yīng)具備高產(chǎn)量sgRNA的合成能力，還應(yīng)兼容各種類型的sgRNA合成，以滿足不同基因編輯的需求，從而拓寬產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。使用翌圣生物的Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit同時合成10種不同序列的sgRNA，實驗結(jié)果表明，該試劑盒能夠高效合成不同序列的sgRNA，在使用過程中無需考慮序列差異的影響。
圖4. 不同序列的sgRNA的合成產(chǎn)量
高純度
合成的sgRNA條帶單一
除了sgRNA的產(chǎn)量，合成的sgRNA的純度也是影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯的效果的關(guān)鍵因素之一。如果合成的sgRNA的純度差，易出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。翌圣Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit合成的sgRNA經(jīng)過安捷倫2100測定，其條帶明顯且無雜帶，說明sgRNA純度高。
圖5. 合成的sgRNA的純度（安捷倫2100測定）
高活性
合成的sgRNA可有效引導(dǎo)Cas9切割靶標DNA
使用翌圣Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit合成的sgRNA與Cas9組合用于體外切割靶DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)所合成的sgRNA可以有效引導(dǎo)Cas9在特定位點切割并產(chǎn)生特定大小的DNA片段。
圖6. sgRNA的剪切效率效果圖
翌圣生物一直深耕基因編輯領(lǐng)域，并推出了一系列高品質(zhì)的原料，旨在為基因編輯技術(shù)的發(fā)展和進步提供支持。除了Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit外，翌圣生物可提供基因編輯相關(guān)蛋白，如Cas9、Cas12a和Cas12b等相關(guān)產(chǎn)品。
基因編輯相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品分類 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
sgRNA合成 | Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit | 11355ES |
Cas蛋白 | Cas9 Nuclease | 14701ES |
ArCas12a Nuclease (10 μM) | 14702ES | |
AapCas12b Nuclease (10 μM) | 14808ES | |
sgRNA純化 | Hieff NGS® RNA Cleaner | 12602ES |
