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克隆技術，又稱為“生物放大技術"，目前應用泛的技術為“分子克隆"，即通過重組技術將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生新的遺傳性狀的技術。
大部分的分子克隆方法，諸如傳統分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉化、篩選等等步驟。其中，載體和片段連接的方法是分子克隆的核心步驟，接下來小翌就具體解析一下載體和片段連接的過程，為您的實驗提供好方法。
根據市面上主要的分子克隆技術，載體與片段的連接過程可分為依賴連接酶的連接、依賴修飾酶的連接以及依賴重組酶的連接。
依賴連接酶的連接
DNA連接酶是一種能夠封閉DNA鏈上缺囗的酶，它借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-磷酸基端與另一DNA鏈的3'-羥基端生成磷酸二酯鍵。根據酶的腺苷酰化依賴不同可分為不同的連接酶：依賴NAD的連接酶和依賴ATP的連接酶。最早發現的DNA連接酶都依賴NAD水解提供能量，直到1970年發現能借助ATP提供能量的DNA連接酶——T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase，T4 Lig），由病毒基因組編碼而成，主要從缺失型噬菌體中提取，噬菌體T4的30基因是該酶的合成基因。該連接酶應用最為廣泛，如翌圣T4 DNA連接酶（Cat#10300ES）。
連接反應由三步完成：
T4 DNA ligase先由ATP供能產生E-AMP復合物；
E-AMP復合物識別雙鏈DNA切口位置，將AMP轉移到5'-P基團，形成5'-P-AMP復合物；
3'-OH親核攻擊5'-P-AMP形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。
圖1. T4 DNA連接酶的作用原理【1】
利用目前已知的T4連接酶的連接特點，在具體的基因工程操作中，科研人員對DNA片段的連接方法分為以下三種：
連接dsDNA的粘性末端
用限制性核酸內切酶酶切，形成具有黏性末端的DNA片段，利用DNA連接酶直接連接；
圖2. 粘性末端酶切連接
連接平末端
對于平末端的DNA片段的連接常利用T4 DNA連接酶連接；
連接人為合成的粘性末端
在DNA片段末端加上poly（dA）-poly（dT）尾，或化學合成的銜接物或接頭，使之形成黏性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。如翌圣普通PCR試劑盒（Cat#10102ES、Cat#10103ES、Cat#10157ES）等，含有Hieff® Taq DNA Polymerase（Cat#10101ES），使得擴增產物末端具有3’-dA，可通過T4連接酶直接用于TA克隆或者NGS接頭連接。
圖3. NGS文庫構建中接頭的連接
依賴修飾酶的連接
這類連接技術不受限制性內切酶酶切位點的限制，而是通過DNA修飾酶進行載體和片段的連接。該技術克服了低連接效率和受限制性內切酶酶切位點限制的問題，使得基因克隆更加靈活，更具有可操控性。
Aslanidis和de Jong于1990年提出不需要限制性內切酶和T4 DNA連接酶的克隆連接法，即利用T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切活性，切割片段和載體，產生12個堿基的5'突出互補末端，利用突出的互補末端之間的退火復性進行基因連接。
圖4. 不依賴連接反應的克隆法【4】
其中，拓撲異構酶是被研究得最詳細的DNA修飾酶，它分為拓撲異構酶I和拓撲異構酶II。拓撲異構酶I催化DNA單鏈的斷裂和重新連接，不需要能量輔助因子如ATP或NAD。拓撲異構酶II能同時斷裂并連接DNA雙鏈，通常需要能量輔助因子ATP。
翌圣TOPO克隆試劑盒（Cat#10906ES、Cat#10907ES、Cat#10909ES），含有拓撲異構酶，該酶通過磷酸鍵偶聯在TOPO載體的兩端，在連接反應中，受插入片段的5'端羥基的攻擊，磷酸鍵釋放能量。利用該能量，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團連接在一起，Topo異構酶從載體分子上脫落，僅需5 min就能完成連接反應。
依賴重組酶的連接
重組酶最早應用于Gateway技術中，它能夠識別、切割特異的重組位點，并連接兩個參與重組的載體和片段。目前應用最為廣泛的技術是Gibson Assembly，原理是通過外切酶產生黏性末端，再通過同源重組酶的連接得到重組片段。
翌圣同源重組克隆試劑盒（Cat#10911ES、Cat#10922ES），預混了重組酶和重組反應所需緩沖液，并添加了的重組增強因子，可顯著提高重組克隆效率。通過PCR產物兩端便分別帶上15-20個與載體序列同源性的堿基，依靠堿基間作用力互補配對成環，不經過酶切，PCR產物和線性化載體在同源重組酶的作用下，經過一定的時間和溫度即可進行轉化，完成定向克隆。
圖5. 同源重組原理
通過連接反應，目的片段和載體已連接組合在一起，成為新的重組DNA質粒。為了表達克隆的目的基因片段，需要將重組質粒導入到大腸桿菌等細胞中，即進行下一步實驗——轉化。那么轉化步驟中應用到的技術和試劑又有哪些呢？關注我們，小翌會在下一期的分子克隆技術專題中給大家具體講解轉化技術，為您的實驗帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~
相關產品列表
產品定位 | 產品名稱 | 產品貨號 | 規格 |
T4連接 | Hieff® Gold T4 DNA Ligase | 10300ES80 | 1000 U |
快速PCR，快至1s/kb | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規PCR | 2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) | 10102ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規PCR，不含染料 | 2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye) | 10103ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
兼容TA/平末端克隆 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES08/20 | 5 T/20 T |
TOPO克隆-TA末端 | Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒 | 10907ES20 | 20 T |
TOPO克隆-平末端 | Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit | 10909ES20 | 20 T |
單片段一步克隆，已發文章累計IF達到1000+ | Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒 | 10911ES20/50 | 20 T/50 T |
1-6片段一步克隆，最快5分鐘完成重組反應 | Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆試劑盒 | 10922ES20/50 | 20 T/50 T |
參考文獻
1.Lohman G J S , Chen L , Evans T C . Kinetic Characterization of Single Strand Break Ligation in Duplex DNA by T4 DNA Ligase[J]. Journal of Biological Chemistry, 2011, 286(51):44187-44196.
2.Anderson HJ, Roberge M. DNA topoisomerase II: a review of its involvement in chromosome structure, DNA replication, transcription and mitosis. Cell Biol Int Rep 1992; 16(8): 717–724.
3.Kunze N, Yang GC, Dolberg M, Sundarp R, Knippers R, Richter A. Structure of the human type I DNA topoisomerase gene. J Biol Chem 1991; 266(15): 9610–9616.
4.Aslanidis C, de Jong PJ. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res, 1990, 18(20): 6069-6073.
