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漲知識 | 克隆專題二：不同分子克隆方法介紹（下）
克隆是英文“clone"或“cloning"的音譯，而英文“clone"則起源于希臘文“Klone"，原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性"的演講上采用“克隆（Clone）"的術語，把“克隆技術"帶到了人們的視野中。
克隆技術又稱為“生物放大技術"，目前應用泛的技術為“分子克隆"，又稱重組DNA技術，即通過重組技術將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術。
之前小翌給小伙伴們介紹了常規(guī)的分子克隆方法，接下來繼續(xù)帶領大家認識一下新的、非常規(guī)的分子克隆技術，包括無縫克隆中的Golden Gate技術、Gateway技術、不依賴基因序列和連接反應的克隆方法等等。
Golden Gate克隆技術通過TypeIIS型限制性內(nèi)切酶（翌圣BsmBI Cat#15203ES、BspQI限制性內(nèi)切酶Cat#15202ES、FuniCut™ BsaI Cat#15005ES）識別目的序列以外的四個堿基，剪切后獲得粘性末端，直接用于目的片段的連接。通過連接酶（翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300）連接形成重組質(zhì)粒，使用轉(zhuǎn)化技術轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中，由于限制性內(nèi)切酶的特性，酶切連接后酶切位點不再存在，能達到精確的無縫克隆。Engler等人利用該技術成功連接了9個目的片段，連接率達90%以上。
圖1. Golden Gate Assembly克隆原理示意圖【1】
圖2. Gateway技術構建表達載體【2】
基本操作流程如下：
圖3. SLIC法構建表達載體的步驟【3】
其具體的操作步驟是，利用PCR技術在目的片段兩側分別加上20-25 bp的同源序列，用DpnI酶（翌圣FuniCut™ DpnI Cat#15052ES）消化處理，組裝片段按合適的比例混勻，加入大腸桿菌細胞裂解物，37℃反應1 h，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，即可實現(xiàn)體外無痕組裝DNA。
圖4. SLiCE技術【4】
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 規(guī)格 |
Golden Gate組裝 | BspQI限制性內(nèi)切酶 (10 U/μL) | 15202ES76 | 500 U |
Golden Gate組裝 | BsmBI（10 U/μL） | 15203ES80 | 1000 U |
通用緩沖液，5min完成精準酶切 | FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶 | 15001ES-15051ES | 50 T |
T4連接 | Hieff® Gold T4 DNA Ligase | 10300ES80 | 1000 U |
5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化 | F DH5α化學感受態(tài) | 11803ES80 | 10×100 μL |
常規(guī)化學感受態(tài) | DH5α 化學感受態(tài)細胞 | 11802ES80 | 10×100 μL |
常規(guī)化學感受態(tài) | 化學感受態(tài)細胞 | 11801ES80 | 10×100 μL |
常規(guī)PCR | 2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) | 10102ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規(guī)PCR，不含染料 | 2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye) | 10103ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
快速PCR，快至1s/kb | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
2.林春晶, 韋正乙, 蔡勤安等. 幾種植物轉(zhuǎn)基因表達載體的構建方法[J].生物技術, 2008(05): 84-87.
3.張陽璞, 楊淑慎. 幾種新型植物基因表達載體的構建方法[J].生物工程學報, 2015, 31(03): 311-327.
4.楊發(fā)譽, 楊云彭, 霍毅欣. 合成生物學中不依賴限制性內(nèi)切酶的分子克隆策略[J].中國生物化學與分子生物學報, 2018, 34(04): 364-370.
