初級會員·13年聯(lián)系電話
隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，重組蛋白的使用在近年來大大增加，為了提高重組蛋白的產(chǎn)量或賦予重組蛋白新的特性（這些特性可以用來對重組蛋白進(jìn)行純化或檢測），可以在克隆過程中添加額外的標(biāo)簽到目標(biāo)蛋白的N端或者C端，標(biāo)簽可根據(jù)功能分為兩類，純化標(biāo)簽和可溶性標(biāo)簽，純化標(biāo)簽可用于親和層析，快速純化蛋白；可溶性標(biāo)簽用于促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，增加可溶性。
常見的標(biāo)簽有6*His、GST、MBP、Strep(Ⅱ)、Flag、SUMO和組合式雙標(biāo)簽或多標(biāo)簽。GST、MBP、SUMO等蛋白標(biāo)簽由于分子量較大，通常需要去除，以消除其對目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的影響；多肽標(biāo)簽（如Strep(Ⅱ)、Flag）分子量較小，免疫原性較低，基本不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，通常可以不用去除，但用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)或其他較高級研究的蛋白通常也要將小分子量多肽標(biāo)簽去除，以達(dá)到最佳效果。實(shí)際操作中化學(xué)切割方法較為少用，因?yàn)椴粌H裂解位點(diǎn)的特異性低，還可能對目的蛋白產(chǎn)生不必要的修飾。目前常用的是反應(yīng)條件溫和且具有高度的位點(diǎn)特異性的酶解法。
表1. 常用的蛋白酶及對應(yīng)切割位點(diǎn)
蛋白酶 | 表達(dá)宿主 | 切割位點(diǎn) | 酶的作用 |
腸激酶 | 大腸桿菌 | Asp-Asp-Asp-Asp-Lys | 去除位于蛋白N-末端的融合蛋白，以除去不需要的標(biāo)簽 |
TEV Protease
| 大腸桿菌 | Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly
| 融合蛋白標(biāo)簽切除
|
3C Protease | 大腸桿菌 | Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro | 特異切割含有3C酶切位點(diǎn)的融合蛋白
|
SUMO Protease | 大腸桿菌 | 識別完整的含有100個氨基酸的SUMO標(biāo)簽蛋白 | 高效地把SUMO從融合蛋白上切割下來
|
牛凝血酶 | 牛的血漿純化制得 | Leu-Val-Pro-Arg-↓-Gly-Ser和Gly-Arg-↓-Gly | 融合蛋白標(biāo)簽切除 |
克隆過程中構(gòu)建相應(yīng)的氨基酸識別序列，即可保證后續(xù)可通過合適的蛋白酶對融合蛋白標(biāo)簽進(jìn)行切除。
小翌已為大家準(zhǔn)備好了性價比的幾款蛋白酶，下面帶大家一一了解下：
重組腸激酶（rEK）是高純度的牛腸激酶輕鏈亞基，它有著和天然提取的腸激酶同樣特異的切割酶活性，切割位點(diǎn)Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，可去除位于蛋白N-末端的融合蛋白，以除去不需要的融合標(biāo)簽，是N末端融合通常選擇的蛋白酶,在其他殘基的不規(guī)則切割發(fā)生水平較低。
翌圣的重組腸激酶（rEK）采用大腸桿菌重組表達(dá)，無外源性的病毒污染，生產(chǎn)過程不使用任何動物源原料，純度高、活性高、特異性強(qiáng)、適用范圍廣，在各種去垢劑和變性劑存在的條件下仍具有部分活性。本品不含標(biāo)簽，由于具有酶切活性，酶切反應(yīng)使用量少，不影響下游蛋白應(yīng)用，可不考慮去除。后續(xù)如需去除可用陰離子交換樹脂（如DEAE-6FF）對其進(jìn)行洗脫。推薦洗脫條件如下：平衡緩沖液：25 mM Tris-HCl pH 8.0，洗脫緩沖液：25 mM Tris-HCl pH 8.0，含100 mM NaCl
凝血酶是由大小分別為31 KD和6 KD的兩條肽鏈通過二硫鍵組成的一種絲氨酸蛋白水解酶，可從動物血漿中利用已激活凝血酶原水解制得；凝血酶切割序列專一，水解效率高，在分子生物學(xué)、生物化學(xué)或生物工程制藥研究中常作為工具酶用于重組融合蛋白（包含凝血酶識別位點(diǎn)）的特異性斷裂。
翌圣的牛凝血酶是從牛的血漿純化制得，具有純度高、比活高、不含有其他蛋白酶活性、滅活病毒、生產(chǎn)穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。該酶最適切割位點(diǎn)：A-B-Pro-Arg-↓-X-Y （其中，A和B為疏水氨基酸，X和Y為非酸性氨基酸），常見的識別序列為：1. Leu-Val-Pro-Arg-↓-Gly-Ser。2. Gly-Arg-↓-Gly。凝血酶可從切割產(chǎn)物中用苯甲脒或肝素瓊脂糖親和純化去除。
翌圣的重組型TEV蛋白酶（rTEV）是經(jīng)過基因工程改造和純化后的重組蛋白酶，不僅保持天然TEV酶的功能活性，且在廣譜的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定性和特異性。rTEV是一種用來切除融合蛋白上親和標(biāo)簽的常用工具酶，具有很強(qiáng)的位點(diǎn)特異性，嚴(yán)格識別七氨基酸序列EXXYXQ↓(G/S)，切割位點(diǎn)在谷氨酰胺和甘氨酸/絲氨酸之間。普遍應(yīng)用的七氨基酸序列為：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly。rTEV在pH 7.0，30℃時可達(dá)到最佳活性，但在pH 6.0-8.5和溫度4-30℃的廣泛范圍內(nèi)皆有活性（見表2），使得反應(yīng)條件的選擇可根據(jù)目的蛋白的情況而靈活變動。另外rTEV切割后也能利用其N端的6×His標(biāo)簽，通過Ni-NTA樹脂去除，以達(dá)到純化目的蛋白的目的。
表2. 不同溫度下rTEV酶切活性
3C蛋白酶是切割小RNA病毒科非結(jié)構(gòu)蛋白的關(guān)鍵酶，在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用。鼻病毒屬于小RNA病毒科，其中的人鼻病毒3C蛋白酶基因編碼區(qū)全長552bp，編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為22000 Da。人鼻病毒3C蛋白酶具有高度的酶切特異性，能特異切割位于Gln-Gly之間的肽鍵，識別位點(diǎn)為 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro。
翌圣將人鼻病毒3C蛋白酶的編碼區(qū)基因，在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，純化后獲得了高純度的重組3C蛋白酶，該蛋白酶能特異切割含有3C酶切位點(diǎn)的融合蛋白，具有良好的生物學(xué)活性。同時，翌圣生產(chǎn)的3C蛋白酶帶有GST和MAT標(biāo)簽蛋白，有利于后期將其從酶切體系中去除。
SUMO蛋白酶識別完整的含有100個氨基酸的SUMO（Small Ubiquitin-like Modifier）標(biāo)簽蛋白，并能高效地把SUMO從融合蛋白上切割下來。與EK和TEV等蛋白酶的識別位點(diǎn)相比，由于其識別序列長，所以SUMO蛋白酶酶切反應(yīng)有很高的特異性，且在較寬范圍的反應(yīng)環(huán)境體系中保持較高的活力，例如溫度（4-30℃）、pH（5.5-9.5）等。SUMO蛋白酶還具有多聚His標(biāo)簽，便于使用親和層析的方法去除SUMO蛋白酶，純化目的蛋白。
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 目錄價/元 |
Enterokinase,Recombinant,Expressed in E.coli | 20401ES60/70/76 | 100 U/200 U /500 U | 425/645/1245 |
Bovine Thrombin,High Specific Activity,>2000 IU/mg 牛凝血酶(高活力,>2000 IU/mg) | 20402ES03/05 | 1 KU/2 KU | 536/956 |
rTEV Protease重組煙草蝕紋病毒蛋白酶 | 20403ES80/92 | 1 KU/ 10×1000U | 215/1595 |
3C Protease | 20409ES60/76/80 | 100 U/500 U /500U×2 | 372/923/1473 |
SUMO Protease | 20410ES60/70/80 | 100 U/500 U /1000U | 223/873/1473 |
DEAE Agarose 6FF | 20540ES25/60 | 25 mL/100 mL | 300/788 |
Heparin Agarose 6FF(肝素親和純化介質(zhì)) | 20493ES08/25 | 5 mL/25 mL | 600/2500 |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin | 20502ES10/50 | 10 mL/50 mL | 678/2848 |
GSTSep Glutathione Agarose Resin | 20507ES10/50/60 | 10 mL/50 mL /100 mL | 928/3848/6898 |
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 目錄價/元 |
Human α-Thrombin(Factor IIa) | 20408ES80 | 1000 U | 2898 |
PreScission Protease(PSP) | 20425ES60/76 | 200 U/500 U | 1126/2136 |
IdeS Protease（免疫球蛋白 G 降解酶） | 20412ES84/90 | 2000 U/ 5000 U | 2233/4953 |
PNGase F (N-糖酰胺酶F或肽N-糖苷酶 F） | 20407ES01/02 | 15000 U/ 75000 U | 1125/4525 |
PNGase F, Recombinant, Expressed in Yeast 酵母重組表達(dá)N-糖苷酶 F | 20415ES01/02 | 15000 U/ 75000 U | 1225/4925 |
Endo H糖苷內(nèi)切酶H | 20414ES92/97 | 10000 U/ 50000 U | 585/2195 |
Endo S糖苷內(nèi)切酶S | 20413ES80/90 | 1000 U/ 5×1000 U | 325/1365 |
Recombinant Trypsin（MS-SAFE） | 20416ES60 | 100 µg | 595 |
