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熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細節，謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結果，發表高分文章，走上人生巔呢？
2009年，Stephen A等人發表文章《The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments》，這是一群qPCR大牛經過商討制定的qPCR實驗和發表文章指南，其目的是為了作者根據指南提供相關的實驗條件和實驗特點，審稿人據此可以評價實驗所用方法的可靠性，其他研究人員也可以利用這些信息進行重復實驗。
MIQE指南由9個部分組成，共涉及85個參數，以保證qPCR實驗的實用性、準確性和可重復性。這9 部分包括實驗設計、樣本、核酸提取、反轉錄、靶標基因、qPCR引物和探針、qPCR實驗報告、qPCR合理性和數據分析。85個參數針對qPCR結果的重要性，分為了兩類：其中標記為“E"表示必須(essential)，標記為“D"表示建議(desirable)。
針對提取得到的RNA等核酸進行量化十分重要，尤其是在比較分析不同樣本時，RNA等核酸投入一致或類似的數量能夠避免一系列不確定因素。另外RNA等核酸的質量評估也必不。常見的量化和質量評估方法有多種，最為常見的是分光光度法，但需要注意的是A260/A280比值必須在中性PH值buffer中進行測量，吸光度比值會受到DNA或者殘余苯酚的影響而改變且不能評估核酸是否發生降解，故最好搭配其他檢測方法，例如瓊脂糖凝膠電泳、或者是參考基因/靶基因3‘：5’完整性檢測。如果RNA樣本部分降解，該信息在發表文章時需要告知，因為低水平轉錄檢測的敏感性可能降低，其中降解帶來的差異可能會造成不同的實驗結論。
RNA提取過程中也應包括DNA酶處理步驟，用以去除相關的基因組DNA污染。建議對RNA樣本是否經過DNA酶處理(包括DNase類型和反應條件)等做好記錄。
核酸中雜質殘留的檢測應通過稀釋樣本做反轉錄以檢測反轉錄活性或PCR抑制程度，或者采用SPUD等抑制實驗。
核酸的結構(例如莖環二級RNA結構)對于反轉錄和PCR的效率有著重要的影響。故而引物、探針和PCR擴增產物的位點需考慮到RNA的折疊。
引物的特異性需用直接的實驗數據驗證有效性，例如凝膠電泳、熔解曲線、DNA測序、擴增子大小、和/或限制性酶切驗證。一些引物優化的證據或方案最好也可提供，理想的形式是退火溫度梯度或Mg2+濃度梯度摸索并以Cq值、熒光與循環曲線圖的形式呈現數量和/或熔解曲線。
所有qPCR反應都需要進行額外的質控或定量標準品，例如使用NTC檢測PCR污染。每96孔板或每批樣品上樣應包括NTC，并確定數據不符合的條件，舉個例子，如果未知低濃度的Cq值為35，則可以忽略Cq值≥40的NTC。
4.1擴增效率
穩定和精確的熒光定量PCR檢測通常和高效的擴增效率相關。尤其當檢測經內參基因校準的目的基因mRNA濃度時，擴增效率尤為重要。△△Cq法是測定樣品間不同基因表達情況用的方法之一，是基于單個內參基因的校準進行的。計算靶標基因和內參基因的Cq值的差異，并直接比較不同樣本之間的△Cq，這種情況需要兩個基因能以可比的效率進行擴增，方能進行比較。
擴增效率必須通過標準曲線來確定，因為這種校準方法提供了一個簡單、快速以及可重復擴增效率、分析敏感性和實驗穩定性的平均指標。擴增效率根據標準曲線對數線性部分的斜率確定。每個靶標基因的的標準曲線需提交在稿件中，這樣審稿人能夠看到。
4.2線性動態范圍
根據生成的標準曲線的模板，動態范圍應至少包括3個數量級，理想狀態是5或6 Log10濃度。標準曲線的線性區間需包括被定量的靶標基因的區間。由于定量下限通常定義不明確，應當確定線性區間內低濃度的變化。同時需要展示相關系數(R2 值)
4.3靈敏度(LOD)
LOD的定義是可以檢測到95%的陽性樣品的低濃度。換言之，在一組含有目的基因的重復實驗中，在LOD濃度下，不應發生超過5%的失敗反應。實際上，我們可以通過有限稀釋法來檢測，失敗和成功反應的百分比覆蓋泊松分布即可。
4.4精度
熒光定量PCR結果的變化有多種原因，包括溫度的差異可影響退火或變性，移液誤差引起的濃度差異和隨機變化。qPCR精度和濃度相關，一般隨著拷貝數的降低而降低。理想情況下，實驗內的重復性應當以SD error bar或具有重復樣品的標準曲線上的CIs的形式顯示在圖中。CVs不應與Cqs一起使用，但可用于表達拷貝數或濃度的差異。
多重實驗大大擴展了qPCR分析的能力，特別是應用于同時檢測點突變或多態性檢測。多重熒光定量PCR實驗需要證明多個靶標的準確量化在同一管中不會受到干擾，即，擴增效率和靈敏度和進行單重實驗時是一致的。這點當豐度較低的靶標基因和豐度高的靶標基因進行共同擴增時尤為重要。
數據分析包括對原始數據的檢查、對數據質量和可靠性的評估，以及生成可報告的結果。
均一化是進行科學qPCR分析的一個重要組成部分，該過程控制核酸抽提效率、反轉錄效率和擴增效率的變化，從而能夠比較不同樣本的RNA濃度。使用內參基因作為內部對照是最常見的均一化RNA數據的方法。均一化包括靶標基因和內參基因的RNA濃度之比。內參基因的RNA應穩定表達，其基因豐度與樣品中mRNA總量呈現強相關。
均一化通常不能用一個內參基因，除非作者可為審稿人提供明確的證據證實內參基因在其實驗條件下表達恒定。內參基因的最佳數目和選擇需通過文章具體實驗確定并報告方法。
生物體本身固有的變異性可能與組間的實驗差異相匹敵，甚至超過后者。尤其是使用許多生物學重復來提高實驗的統計學重要性時，這種變化就變得顯而易見。雖然生物重復間的差異可能很大，但是足夠數量的樣本可以減少實驗差異性。許多因素會導致實驗變異，從而影響到達統計所需的生物重復的數量。因此，功效分析(power analysis)有助于確定有效可靠結論所需的樣本數。
使用PCR僅檢測核酸是否存在，而不是對其進行準確定量，被稱為定性PCR，該方式廣泛應用于病原體診斷。PCR方法定性/定量分層問題在于，準確回答是或否，需要低敏感性PCR實驗的敏感性信息。因此，即使是定性分析也應提供有關分析能力的相關信息。
建議將縮寫qPCR用于real-time PCR，并將RT-qPCR用于反轉錄-qPCR。將RT-PCR簡稱為qPCR會引起混淆，并且與傳統RT-PCR的應用不符。
內參基因
內參基因應當指的是參照基因(reference genes)，而不是管家基因(housekeeping genes)。
TaqMan探針應指為水解探針(hydrolysis probes)。
FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 熒光共振能量轉移探針)指的是一種機制，指發射/猝滅依賴于兩個熒光染料分子的電子激發態之間相互作用。LightCycler型探針指的是雙雜交探針(dual hybridization probes) 。
牛津英語詞典只列出了定量(quantification)，非定量(non-quantification)，因quantification是恰當的，而不是quantitation。
現在文獻中使用的閾值循環(threshold cycle, Ct)，交點(crossing point, Cp)和分支點(take-off point, TOP) 與PCR循環的術語不一致。這些術語指的實際上是相同的值，只是由于不同儀器廠家由于產品差異化的原因造成的，不具有科學的準確性和清晰性。根據RDML（Real-Time PCR Data Markup Language）數據標準，建議統一使用定量循環(quantification cycle, Cq)這個術語。
方法 | 分類 | 產品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
動物組織/細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
簡單植物總RNA提取，避開有毒試劑，最快40min完成 | MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 | 19291ES | |
多糖多酚植物總RNA提取，最快30min完成 | MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | 19292ES | |
細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快8 min完成 | MolPure® Cell RNA Kit 培養細胞RNA提取試劑盒 | 19231ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏通用型定量預混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
定量預混液 (染料法)，已發文章累計IF達到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES | ||
高靈敏型qPCR預混液（染料法） | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11198ES | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11199ES | ||
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11200ES | ||
miRNA加A法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） | 11171ES | |
miRNA莖環法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（莖環法） | 11170ES | |
高靈敏一步法反轉定量試劑盒(染料法) | Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit | 11143ES | |
細胞直擴RT-qPCR，1.5 h從細胞到基因表達分析(染料法) | Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit | 11172ES | |
反轉錄試劑 | 5 min快速反轉，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-示蹤版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149ES |
5 min快速反轉，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-常規版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） | 11150ES | |
15 min一步完成gDNA去除與反轉錄(下游應用qPCR) | Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR | 11142ES | |
鏈cDNA合成預混液，含gDNA去除(下游應用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES | |
常規30 min反轉預混液,含gDNA去除（下游應用qPCR） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES | |
miRNA反轉錄試劑盒（加A法） | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） | 11148ES |
