T4噬菌體基因32編碼蛋白(T4 gene 32 protein，gp32)是一種單鏈DNA（ssDNA）結(jié)合蛋白，為T4噬菌體DNA復(fù)制和修復(fù)所必需。它被廣泛地用于穩(wěn)定和標記ssDNA區(qū)域，以便用電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)DNA的結(jié)構(gòu)、促進限制性內(nèi)切酶的消化反應(yīng)、提高RT-PCR中反轉(zhuǎn)錄的效率、增強T4 DNA聚合酶的活性和提高PCR的產(chǎn)量等。
T4 gene 32 protein的結(jié)構(gòu)T4 gene 32 protein由301個氨基酸組成，大小為34 kDa，包含三個不同的結(jié)構(gòu)域：核心結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域（NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（CTD）。核心結(jié)構(gòu)域：包含ssDNA的結(jié)合位點，并具區(qū)分單鏈、雙鏈DNA的能力；
C端結(jié)構(gòu)域（CTD）：涉及異型蛋白相互作用，帶負電荷，調(diào)節(jié)gp32與復(fù)制、修復(fù)和重組機制中其他成分的相互作用；
N端結(jié)構(gòu)域（NTD）：負責同型蛋白相互作用，帶正電荷，與鄰近的gp32單體的核心結(jié)構(gòu)域之間通過蛋白-蛋白接觸，使gp32蛋白以頭-尾方向結(jié)合ssDNA。
T4 gene 32 protein介導(dǎo)的DNA重組修復(fù)DNA損傷時，后隨鏈合成岡崎片段，gp32與前導(dǎo)鏈結(jié)合當前導(dǎo)鏈聚合酶(紅色)在DNA損傷處（X）停滯時，前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成會解耦聯(lián)，后隨鏈的合成機制可以合成與受損部位重疊的岡崎片段(綠線)，同時會在停滯的前導(dǎo)鏈聚合酶前面打開一個ssDNA缺口，該缺口被gp32覆蓋(橙色)；
gp32單體簇通過阻止Dda解旋酶加載到后隨鏈上來阻止其對復(fù)制叉移動的刺激，并促進模板子鏈3 '端的解旋；
模板轉(zhuǎn)換恢復(fù)復(fù)制叉移動
UvsX重組酶和Dda解旋酶催化模板轉(zhuǎn)換來恢復(fù)停滯的復(fù)制叉；
圖2. gp32介導(dǎo)的重組修復(fù)過程[2]
T4 gene 32 protein應(yīng)用（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）該技術(shù)可以在37~42 ℃條件下實現(xiàn)待測靶標的快速檢測，具有反應(yīng)靈敏度高、特異性強、對儀器依賴程度低且可整合多種檢測模式等優(yōu)點，特別適用于基層和現(xiàn)場即時檢測，可廣泛應(yīng)用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。
圖3. 重組酶聚合酶擴增RPA技術(shù)擴增原理圖[3]
重組酶T4 UvsX在ATP的參與和定位因子（T4 UvsY）的幫助下與擴增引物結(jié)合形成重組酶引物復(fù)合體，并在雙鏈DNA中尋找同源序列；
重組酶引物復(fù)合體一旦定位到同源序列，則會插入雙鏈DNA形成D-環(huán)結(jié)構(gòu)，啟動鏈置換反應(yīng)，單鏈結(jié)合蛋白gp32會與解開的DNA鏈結(jié)合防止進一步被置換；
重組酶T4 UvsX從重組酶引物復(fù)合體中被水解，3'端引物暴露并與Bsu DNA聚合酶結(jié)合，DNA開始復(fù)制延伸，最終兩條母鏈分離，形成兩條新的互補雙鏈DNA。該反應(yīng)在37-42℃下進行，可在30 min內(nèi)實現(xiàn)目標序列1012倍的擴增。
（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）該技術(shù)由一對引物介導(dǎo)，反應(yīng)在42℃進行，可在2 h左右將模板RNA擴增約109～1012倍，不需特殊的儀器，具有較高的特異性和靈敏度。廣泛應(yīng)用于病毒、細菌、霉菌、寄生蟲和細胞因子等的檢測，特別是用于艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒等RNA病毒的檢測當中。在動物疫病預(yù)防控制方面，NASBA方法已成為診斷病毒的國家診斷標準方法之一（GB/T19440-2004 病毒NASBA 檢測方法）。
在NASBA中加入gp32，可以穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄形成的單鏈cDNA，減少NASBA中對熱退火步驟的依賴，提高NASBA程序的簡單性。
1）PCR擴增中，使用gp32可以顯著地提高片段的擴增長度及產(chǎn)量[5]，并減輕血紅素、腐殖酸等抑制物的對PCR擴增的抑制作用[6]。如圖5所示，將濃度的抑制劑加入含有5 pg模板DNA的反應(yīng)混合物中，另外在不添加抑制劑的情況下，檢測0.05、0.5和5 pg模板DNA的擴增情況。結(jié)果顯示在PCR體系種添加gp32可顯著減輕抑制劑對PCR擴增的抑制。
圖5. T4 gene 32 protein解除抑制劑對PCR的干擾[6]。A：不含gp32的標準PCR條件；B：含有150 ng/mL gp32的PCR條件
2）Gp32通過阻止模板ssDNA和RNA二級結(jié)構(gòu)的形成，分別增強T7 RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，從而增加體外轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)量[7]。
翌圣的T4 gene 32 protein由ZymeEditor酶改造平臺重組表達而來，蛋白純度高，核酸酶殘留水平低，批次間穩(wěn)定性優(yōu)異，宿主DNA殘留水平極低，適用于RPA、NASBA技術(shù)、PCR、NGS文庫構(gòu)建等應(yīng)用。
圖5.客戶測試翌圣重組酶聚合酶核心酶原料擴增結(jié)果圖
注：2、4為陽性實驗組；1、3為陰性對照組
客戶采用翌圣Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)、T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)、T4 UvsY protein (2 μg/μL)、T4 gene 32 protein (gp 32)、肌酸激酶Creatine Kinase (2 μg/μL) 進行RPA擴增反應(yīng)，得到正確的目的條帶，且條帶清晰、明亮，結(jié)果表明，翌圣重組酶聚合酶擴增核心酶原料可實現(xiàn)高效RPA等溫擴增。
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品作用 |
Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL) | 11078ES | 結(jié)合引物與原始靶核酸序列互補合成新的DNA模板 |
T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL) | 11079ES | 具有配對和鏈轉(zhuǎn)移活性的重組酶 |
T4 UvsY protein (2 μg/μL) | 11080ES | 重組酶輔助因子，刺激T4 UvsX的單鏈DNA依賴性ATP酶活性并降低活性所需的T4 UvsX臨界濃度 |
T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌體基因32編碼蛋白 | 11081ES | 參與DNA復(fù)制、修復(fù)、重組與解鏈后的單鏈DNA結(jié)合，防止自雜交 |
Creatine Kinase (2 μg/μL) 肌酸激酶 | 14502ES | 刺激ATP和肌酸分解為磷酸肌酸和ADP，釋放能量 |
Exonuclease III (100 U/μL) | 14525ES | 具有3’→5’外切酶活性，切斷熒光探針中淬滅基團，釋放熒光 |
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