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內(nèi)參抗體你選對了嗎?
各位小伙伴，您是否在蛋白免疫印記時，面對各種內(nèi)參抗體而不知所措呢，內(nèi)參蛋白是生物體內(nèi)管家基因編碼的，在多組織中穩(wěn)定表達，用于驗證免疫學(xué)實驗中是否正常進行和一種半定量檢測蛋白表達的標準對照，那么如何正確的選擇內(nèi)參抗體呢！可以從以下幾點去參考。
一、樣本種屬來源
1. 哺乳動物組織或著細胞來源的樣本，一般選擇β-actin、α-tubulin、GAPDH、Lamin- B、Histone H3、Na+/K+-ATPase。
2. 植物來源樣本，一般選擇plant actin、Rubisco等。
3. 其他研究較稀少的樣本，通過查詢相關(guān)文獻或數(shù)據(jù)庫，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參推薦ICG網(wǎng)站
二、目的蛋白分子量
保證目的蛋白分子量與內(nèi)參相差大于5KDa以上，防止檢測時干擾，例如，目的蛋白為40KDa，不宜選擇β-actin（42KDa）作內(nèi)參，可考慮GAPDH (36KDa) 或者β-tubulin(55KDa)作為內(nèi)參。
三、內(nèi)參蛋白表達部位
因此，提取蛋白的部位不同，選擇的內(nèi)參蛋白也不同。比如有時胞質(zhì)、胞核分開提取而不提取總蛋白時，就要選擇相應(yīng)部位表達的內(nèi)參蛋白。如 H3在細胞核中高效穩(wěn)定表達，理論上在細胞質(zhì)不表達，那么對于胞質(zhì)提取的蛋白，就不能選用H3作為內(nèi)參蛋白，而應(yīng)該選擇細胞質(zhì)中表達的β-actin 、GAPDH α-Tubulin等作為內(nèi)參蛋白。（內(nèi)參評價推薦軟件geNorm、NormFinder）
亞細胞定位 | 內(nèi)參 | 分子量KDa | 注意事項 |
胞漿、全細胞 | β-actin |
42 | 不適用于細胞核提取物，因為β-actin是染色質(zhì)重塑復(fù)合物中的組分;可能不適合于研究對象之間年齡差異大的情況 |
α-Tubulin | 55 | 可能不適合于研究對象之間年齡差異大的情況，微管蛋白的表達隨著抗菌和抗有絲分裂抗性藥物而改變，因此在加入抗癌和抗真菌藥物時 | |
β-Tubulin | 55 | ||
GAPDH |
36 | 組織細胞缺氧會引起GAPDH表達上調(diào)，因此不適用于與氧有關(guān)的研究，糖尿病等因素會導(dǎo)致 GAPDH的表達量增高 | |
Vinculin | 117 | 大分子量蛋白可參考 | |
線粒體 | COXIV 系列 | 15-17 | 該系列蛋白主要集中于15-17KDa,如果目標蛋白分子量接近，可考慮其他內(nèi)參 |
HSP60 | 60 | ||
細胞核 | VDAC1/2 | 31-37 | 該系列蛋白主要集中于31-37KDa |
Lamin B1 | 66 | 不是適用于胚胎干細胞，凋亡實驗中不適合做內(nèi)參 | |
PCNA | 36 | 非增值細胞不適用 | |
TBP | 33-43 | TBP在人類中是37-43KDa,在小鼠和大鼠中是33-36KDa，不適合凋亡實驗 | |
YY1 | 65-70 | ||
Histone H3 | 17 | 多數(shù)蛋白分子量在17KDa左右，如果目標蛋白分子量接近，可考慮其他內(nèi)參 | |
全血、血清、血漿 | Transferrin | 77 | 表達狀況受某些疾病狀態(tài)和治療的影響，比如視黃酸 |
Albumin | 66 | 含量*，注意降低WB實驗上樣 |
標簽抗體搭配使用效果更佳
在研究蛋白相關(guān)相互作用等實驗中比如pull down, 通過分子生物學(xué)手段，表位標簽可融合至目的蛋白的 N或C 末端，常用的表位標簽有 His、HA、Myc和GST 等。這些表位標簽通常不會影響目的蛋白的生物活性和細胞內(nèi)定位。表位標簽的出現(xiàn)，為科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)提供了方便。
表位標簽 | 標簽序列 | 分子量 | 標簽抗體 |
HA 標簽 | YPYDVPDYA | 1.1 KD | HA 標簽抗體 |
Myc 標簽 | EQKLISEEDL | 1.2 KD | Myc 標簽抗體 |
DYKDDDDK | DYKDDDDK | 1 KD | DYKDDDDK (FLAG® 表位標簽) 抗體 |
GST Tag | - | 26 KD | GST 標簽抗體 |
GFP Tag | - | 26.9 KD | GFP 標簽抗體 |
V5 標簽 | GKPIPNPLLGLDST | 1.4 KD | V5 標簽抗體 |
S-tag | KETAAAKFERQHMDS | 1.8 KD | S 標簽抗體 |
E-tag | GAPVPYPDPLEPR | 1.4 KD | E 標簽抗體 |
類型 | 產(chǎn)品名稱 | 分子量 | 產(chǎn)品編號 |
內(nèi)參抗體 | β-actin, Mouse mAb 小鼠抗β-actin單克隆抗體 | 42 kDa | 30101ES |
β-actin, Rabbit pAb 兔抗β-actin多克隆抗體 | 42 kDa | 30102ES | |
GAPDH (Clone:1A6), Mouse mAb 小鼠抗GAPDH 單克隆抗體 | 36 kDa | 30201ES | |
GAPDH, Rabbit pAb 兔抗GAPDH多克隆抗體 | 36 kDa | 30202ES | |
α-Tubulin, Mouse mAb 小鼠抗α-Tubulin單克隆抗體 | 50-55 kDa | 30304ES | |
β-Tubulin, Mouse mAb 小鼠抗β-Tubulin單克隆抗體 | 50-55 kDa | 30301ES | |
β-Tubulin, Rabbit pAb 兔抗β-Tubulin多克隆抗體 | 50-55 kDa | 30302ES |
類型 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 |
標簽抗體 | His-tag, Mouse mAb 小鼠抗His-tag單克隆抗體 | 30401ES |
His-tag, Rabbit pAb兔抗His-tag多克隆抗體 | 30402ES | |
Flag-Tag (DYKDDDDK), Rabbit pAb 兔抗Flag-Tag多克隆抗體（DYKDDDDK） | 30501ES | |
小鼠抗Flag-Tag單克隆抗體（DYKDDDDK） Flag-Tag (DYKDDDDK), Mouse mAb | 30503ES | |
Myc-tag, Mouse mAb小鼠抗Myc-tag單克隆抗體 | 30601ES | |
HA-Tag, Mouse mAb小鼠抗HA-Tag單克隆抗體 | 30701ES | |
HA-Tag, Rabbit pAb兔抗HA-Tag多克隆抗體 | 30702ES | |
V5-Tag, Mouse mAb小鼠抗V5-Tag單克隆抗體 | 30801ES | |
GST-tag, Mouse mAb 小鼠抗GST-tag單克隆抗體 | 30901ES | |
GST-tag, Rabbit pAb 兔抗GST-tag多克隆抗體 | 30902ES | |
GFP-tag, Mouse mAb 小鼠抗GFP-tag單克隆抗體 | 31001ES | |
GFP-tag, Rabbit pAb 兔抗GFP-tag多克隆抗體 | 31002ES | |
RFP-tag, Mouse mAb 小鼠抗RFP-tag單克隆抗體 | 31101ES | |
MBP-tag, Rabbit pAb 兔抗MBP-tag多克隆抗體 | 31201ES |
類型 | 名稱 | 貨號 |
親和純化凝膠 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag親和純化凝膠） | 20585ES |
Anti-HA Affinity Gel （Anti-HA親和純化凝膠） | 20586ES | |
Anti-Myc Affinity Gel（Anti-Myc親和純化凝膠） | 20587ES | |
Anti-V5 Affinity Gel（Anti-V5標簽親和純化凝膠） | 20588ES | |
Anti-His Affinity Gel（Anti-His標簽親和純化凝膠） | 20589ES |
文獻引用：
[1]Zheng G, Jiang C, Li Y, et al. TMEM43-S358L mutation enhances NF-κB-TGFβ signal cascade in arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy[J]. Protein & cell, 2018: 1-16.
IF（6.228）
[2] Wang T, Wang J, Wang J, et al. HAP1 is an in vivo UBE3A target that augments autophagy in a mouse model of Angelman syndrome[J]. Neurobiology of disease, 2019, 132: 104585. 30101 IF 5.36
[3] Peng RR, Wang LL, Gao WY, et al. The 5.8S pre-rRNA maturation factor, M-phase phosphoprotein 6, is a female fertility factor required for oocyte quality and meiosis. Cell Prolif. 2020;53(3):e12769.
GAPDH IF: 5.753
[4] Tan K S, Zhang Y, Liu L, et al. Molecular cloning and characterization of an atypical butyrylcholinesterase-like protein in zebrafish[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2021: 110590. Flag-Tag (DYKDDDDK), mouse 30503ES20
[5] Zhuang W, Yan Z. The S2–S3 Loop of Kv7. 4 Channels Is Essential for Calmodulin Regulation of Channel Activation[J]. Frontiers in Physiology, 2020, 11. 30601ES20
[6] Wang Y, Hou Y, Qiu J, et al. Abscisic acid promotes jasmonic acid biosynthesis via a ‘SAPK10 ‐bZIP72‐AOC’pathway to synergistically inhibit seed germination in rice (Oryza sativa)[J]. The New Phytologist, 2020, 228(4): 1336. GST\HIS\GFP coip
[7] S Chen, et al. Novel Role for Tranilast in Regulating NLRP 3 Ubiquitination, Vascular Inflammation, and Atherosclerosis JAHA. June 16, 2020 Vol 9, Issue 12 αTUBULIN
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