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攻無不“克”的無縫克隆為何備受青睞?

2022-3-18  閱讀(731)

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攻無不“克"的無縫克隆為何備受青睞?


導讀


在經歷了多次PCR、酶切、連接、轉化后,有些小伙伴仍會面臨克隆陽性率低的情況,每一步都認真地完成,但仍然存在不少的問題。今天小翌給大家介紹一下近年來備受科學家們青睞的“無縫克隆"。相比于傳統的酶切克隆,無縫克隆更快更靈活,不受酶切位點限制,可以在質粒的任何位點進行一個或多個DNA段的插入。

傳統酶切克隆

1. 受限制性內切酶的限制
2. 連接效率低:T4 DNA連接酶連接效率具有序列的偏好性
3. 耗時長:酶連過夜
4. 多片段克隆困難

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圖1.傳統酶切克隆

無縫克隆

1. 無需考慮酶切位點,適用任意載體、任意片段
2. 陽性率高,可用于50 bp -10 kb的片段
3. 連接快速,20-30 min即可完成
4. 可用于多片段克隆、基因突變、多順反子表達載體構建

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圖2.無縫克隆


無縫克隆的原理

與傳統的雙酶切克隆一般,無縫克隆依賴于dsDNA的黏性末端進行互補配對,但無縫克隆并不使用內切酶來制造黏性末端,而是通過T5核酸外切酶來產生的。T5核酸外切酶能夠沿著5’→3’方向,降解dsDNA,從而產生黏性末端,但是,T5外切酶并不能保證每一個片段5’端都會酶切成一樣長的粘性末端。因此退火之后,無縫克隆中的DNA聚合酶會針對缺失的堿基進行添加,Taq連接酶催化堿基之間形成磷酸二酯鍵,將所有缺口補齊。

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圖3.無縫克隆原理圖


無縫克隆優勢詳解

1. 不受片段、載體序列的限制,可任意組裝


傳統的酶切克隆:克隆載體的多克隆位點需攜帶可用的單一酶切位點,同時酶切位點若存在于外源片段也會極大程度限制克隆。此外,還需要購買各式各樣不同的內切酶。

無縫克隆:僅靠同源臂進行互補配對。

2. 可同時無縫地拼接多個片段


傳統的酶切克隆:由于酶切位點的限制和酶切位點之間存在著一定的距離和交叉覆蓋,可組裝的片段有限,酶切克隆通常需要分多次拼接,一般只能拼接2-3個片段,耗時耗力。

無縫克隆:可同時拼接4-6個片段,并且只需要將所有片段混在一個試劑管中反應即可。

3. 操作簡便,時間上大大節省


傳統的酶切克隆:傳統的片段和載體酶切均需要2-4小時,此外還需要對相關產物進行末端補平、磷酸化、產物純化等一系列操作。為保證連接成功,還需在16℃條件下過夜連接。

無縫克隆:僅需PCR和膠回收,連接體系反應時間為20min左右,連接單個和多個片段的時間一致。相比于傳統酶切克隆,可節約1天左右的時間。


無縫克隆操作步驟

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圖4.無縫克隆關鍵步驟

1. 線性化載體制備


① 線性化方式:酶切或者PCR;
② 產物純化:膠回收/PCR產物純化;

2. PCR獲取目的插入片段


5’引物需要和線性化載體末端15-25 bp的序列重疊。

小翌推薦使用引物設計工具:122.112.245.84:8080/hieff-clone/

3. 重組反應

按一定比例將線性化載體與插入片段進行混合,50℃反應20 min后即可用于轉化。

分子克隆發展至今,翌圣利用同源同組的原理,匠心研發了多款一步法快速克隆產品。自產品上市以來,受到了諸多客戶的支持,備受好評。以下是部分產品的性能展示:

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圖5. Hieff Clone® One Step Cloning Kit(CAS#10911)試劑盒可以有效克隆不同長度的單片段基因。載體:4.7 kb。插入片段:1.2 kb,3 kb和5 kb。

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圖6.Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit(CAS#10912)試劑盒進行3個片段克隆。載體:10 kb。插入片段:1 kb,1.5 kb和2.5 kb。

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圖7.Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit(CAS#10922)試劑盒進行5個片段克隆(上)、6個片段克隆(下)。載體:5 kb。插入片段:4kb(上)和5 kb(下)。


產品已發表文獻


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1. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017. (IF 37.205)

2. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019. (IF 31.398)

3. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16. (IF 31.398)

4. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria[J]. Nat Cell Biol. 2018 Oct;20(10):1145-1158. (IF 20.46)

5. Li X., et al., Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection[J]. Mol Cell. 2017 Jul 20;67(2):214-227.e7. (IF 14.548)

6. Yao R W, Xu G, Wang Y, et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus[J]. Molecular cell, 2019. (IF 14.548)

7. Wu P, Zhang T, Liu B, et al. Mechano-regulation of peptide-MHC class I conformations determines TCR antigen recognition[J]. Molecular cell, 2019, 73(5): 1015-1027. e7. (IF 14.548)

8. Qiao HH, Wang F, et al. An efficient and multiple target transgenic RNAi technique with low toxicity in Drosophila[J]. Nat Commun. 2018 Oct 8;9(1):4160. (IF 12.353)



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