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【干貨+試用】一文get核酸片段化酶知識要點
近小翊在后臺收到一封留言，說建庫的片段化儀器壞了，不能做超聲打斷，問有沒有其他核酸打斷的方法推薦。
核酸打斷的方法可以分為機器法和試劑法。其中機器法包含接觸式和非接觸式，接觸式主要包括探頭式和水浴超聲兩大類，這類方法比較實惠，但是直接接觸樣本會導致樣本損耗和污染，非接觸式主要包括Diagennode和Covaris這兩個品牌，這類儀器和耗材的成本太高，單個樣本的耗材成本達20-50元。試劑法指的是采用片段化酶對核酸進行打斷，這類方法成本較低，操作簡便省時，只需要在樣本中加入片段化酶，再反應一段時間即可完成反應。市面上報道可用于核酸打斷的片段化酶有很多，包括應用于高通量測序的Tn5轉座酶、NEB公司推出的Fragmentase、DNase I和Endonuclease V等。這里小翊就借花獻佛，將試劑法核酸片段化酶的資料整理出來與大家分享。
DNase Ⅰ
DNase I（Deoxyribonuclease I）：中文名稱為脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈寡脫氧核苷酸的核酸內切酶。DNase I水解單鏈或雙鏈DNA后的產物，5'端為磷酸基團，3'端為羥基。DNase Ⅰ酶切底物DNA通常依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。
常見應用：
?RNA樣本中DNA的消化
?體外轉錄后去除模板DNA
?通過切口平移與DNA聚合酶I一起進行DNA標記
?dsDNA酶切，生成隨機的DNA文庫
在鎂離子存在條件下，DNase I隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；二價錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。
圖 DNase Ⅰ在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA。圖片來源于Thermo
DNase Ⅰ在不同的離子存在下可以片段化dsDNA，然后實際操作中卻易受到多種條件的影響，如酶的用量，反應溫度，底物DNA的純度等。此外研究發現DNase Ⅰ對嘧啶核苷酸旁邊位點有偏好性，大大影響終文庫的多樣性[1]。
Endonuclease V
核酸內切酶 V 是在E. coli 中發現的一種 DNA 修復酶。其識別脫氧肌苷（脫氧腺苷在DNA中的脫氨基產物），對錯配的脫氧肌苷3′ 端第二個磷酸二酯鍵進行切割，產生一個 3′ 羥基、5′ 磷酸的切刻。除此之外在較小程度上可以識別AP位點，基因錯配的DNA位點，插入/缺失不匹配等位點。
常見應用：
?突變研究
?DNA修復
?錯配剪切
?基因分型
?DNA重組
圖 Endonuclease V可識別AP位點或尿素、堿基錯配、插入/缺失錯配、發夾結構的 DNA。圖片來源于Thermo
2002年，日本學者Kentaro Miyazaki使用Endonuclease V用于DNA樣本的隨機片段化。由于Endonuclease V可特異性識別尿嘧啶，因而可以通過調節DNA中尿嘧啶的殘留量來控制終Endonuclease V酶切的長度。結果表明在沒有dUTP的情況下，DNA不會被酶切（Lane 1），當dTTP/dUTP的比例降低時，片段的平均長度也隨之降低（Lane 2，3，4），當dUTP*替代dTTP的時候，DNA會被切割的很短（Lane 5）[1]。
圖 不同的dTTP/dUTP濃度比例條件下，DNA被酶切后的片段分布電泳圖
Endonuclease V一般識別特定的位點，本研究中通過PCR隨機引入尿嘧啶可用于DNA的隨機片段化。由于堿基序列組成的差異，樣本的GC含量對Endonuclease V片段化效果有潛在影響，實際操作中尤其是NGS應用中也會受到諸多條件的限制。
dsDNA Fragmentase
dsDNA Fragmentase是NEB公司推出的一款片段化酶，以單酶的形式出售。該產品實際上是兩種酶按一定比例組合成的混合酶體系，一種酶在DNA雙鏈上隨機產生缺刻，另一種酶識別這個缺刻并在互補鏈上切割，從而產生DNA雙鏈斷裂。Fragmentase進行雙鏈DNA-片段化反應后產生帶有5’磷酸和3’羥基的短突出粘性末端DNA -片段。
該酶通過改變酶切時間將DNA酶切至特定大小的DNA -片段，與初始的Input DNA量以及Input DNA長度無關。
圖 不同起始量的gDNA不同酶切時間后的片段分布。圖片來源于NEB
圖 不同長度的gDNA不同酶切時間后的片段分布。圖片來源于NEB
Tn5
NexteraXT技術相信大家都不陌生，2011年1月，Illumina宣布收購Epicentre生物技術公司，于是理所當然的Epicentre公司的Nextera技術核心也歸illumina公司所有。
NexteraXT將P5/P7端部分接頭序列和轉座子末端序列形成包被接頭與Tn5形成轉座復合體，該復合體會打斷受體DNA，形成一端帶有P5部分的Adapter1,一端帶有P7部分Adapter2的DNA，之后通過PCR加上index序列以及接頭其余部分，形成完整的文庫，整個建庫流程僅需90 min。
圖 Tn5轉座酶建庫原理示意圖
Tn5也借此引爆極速建庫之戰，而競爭對手也并沒有坐以待斃，Thermo用Mu轉座酶推出了Museek Library Preparation Kit for Ion Torrent；Agilent 推出Vibrio(哈式弧菌)，Vibrio與Tn5序列之間的相似性高達40%。盡管如此，其市場反饋以及實際情況都不如Tn5。
同時Tn5由于其片段化的偏好性經常受到競爭對手的詬病。據統計Tn5在插入位點兩側9個堿基左右有明顯的偏好性。
圖 轉座酶插入位置前后9堿基左右有明顯的偏好性。圖片來源于網絡
片段化酶小結
片段化酶與NGS
NGS因其檢測靈敏度高，特異性高且兼具定性和定量檢測，在NIPT，腫瘤基因突變，PGD/PGS等領域展現了極為廣闊的臨床與科研應用前景。
然而受限于平臺測序讀長短的不足，建庫前需隨DNA進行隨機打斷。目前主要是以機械法為主（如Covaris），但是超聲本就是物理方法打斷，會對DNA造成明顯的損傷，且超聲儀器與耗材成本居高不下，這對競爭激烈的NGS下游服務企業來說，成本太過高昂。因而這也將是以片段化酶+常規建庫試劑搭配的酶切法建庫試劑盒進入市場的重要契機。
對于不同的片段化酶來說，Tn5依然是目前市場上極速建庫的wang者，然而另一方面Tn5在建庫中所表現出的偏好性也使得不少的客戶望而卻步。因此像DNase Ⅰ、Endonuclease Ⅴ以及Fragmentase在市場上初露鋒芒，其中DNase Ⅰ與Endonuclease Ⅴ因其各自的不足尚未被*開發利用，Fragmentase則是目前NGS端為大眾所熟知的片段化酶。
精品推薦
翊圣生物結合自身分子酶的創新研發，推出片段化酶Smearase，本產品酶切效果僅與酶切時間有關而與樣本類型GC含量以及Input DNA無關。以此為核心的酶切法建庫試劑盒Hieff NGS® OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina擺脫了繁瑣的超聲過程，同時簡化了操作流程，極大的降低了建庫的時間和成本。并且針對FFPE樣本也能獲得優異的測序結果。
產品特點：
1、操作簡便：片段化/末端修復/加A一步完成
2、穩定酶切：酶切效果僅與時間有關，不受物種類型與Input DNA影響
3、偏好性低：酶切偏好性遠低于Tn5
4、適用范圍廣：不僅適用于常規gDNA，cDNA，還適用于FFPE等樣本
性能展示：
圖 不同酶切時間后樣本片段分布情況‘
訂購/試用裝信息：
類型 | 名稱 | 貨號 | 規格 | 價格/元 |
試劑盒 | Hieff NGS® OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12204ES08 | 8 T | 3683.00 |
12204ES24 | 24 T | 7583.00 | ||
12204ES96 | 96 T | 28663.00 | ||
片段化酶 | Hieff® Smearase | 12907ES08 | 8 T | 563.00 |
12907ES24 | 24 T | 1263.00 | ||
12907ES96 | 96 T | 4663.00 |
參考文獻：
Miyazaki K. Random DNA fragmentation with endonuclease V: application to DNA shuffling. Nucleic Acids Res. 2002 Dec 15;30(24):e139.
