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實驗室常用到的實驗：逆轉錄實驗
實驗人員通過體外模擬病毒復制過程，以提取的RNA為模板，使用逆轉錄酶催化，合成出與RNA互補的cDNA鏈。終構建cDNA文庫，并從中篩選所需的靶標基因。
BUT！小伙伴們做逆轉錄實驗時，
1）有沒有深究過RNA逆轉錄出的cDNA能不能真實反映出基因表達信息？
2）做實驗時，有沒有發生過內參做的很好，目的基因做不出的情況？
如果有發生上述情況，那么需要重新評估逆轉錄實驗結果的有效性。
逆轉錄結果有效性的評定
逆轉錄實驗結果有效性的評定重要的是盡可能反映樣本中原始RNA模板的信息，即均一性地將RNA逆轉錄生成cDNA。理論上來講，不考慮堿基組成的影響，均一性體現在不同位置處的片段同等效率地合成cDNA，進而保證真實地反映轉錄譜中不同基因的實際豐度。
逆轉錄實驗的成功與RNA模板、逆轉錄酶、引物及反應程序等有關。當我們實驗做不成功時，大家會優先從模板、逆轉錄酶來找原因，往往忽略引物在其中起的作用，其實引物對逆轉錄成敗也至關重要。
今天小翊就跟大家討論下逆轉錄引物的分類和選擇。
逆轉引物的分類和選擇
逆轉錄引物有三類，Oligo dT引物、隨機引物、基因特異性引物（GSP，Gene Specific Primer）。
1）Oligo dT引物：
若干dTTP組成的引物，可以和真核生物mRNA的Poly A尾配對，與模板結合特異性高。因該特異性，常適用于獲取轉錄本靠近3’末端序列。它不適用于降解的RNA模板，也不適用于缺少A尾的RNA，如原核生物RNA和miRNA。當RNA模板降解時或RNA內部中有復雜二級結構時，會造成cDNA合成長度變短，無法有效合成靠近RNA 模板5’末端的序列。這是影響均一性的常見因素。
也常見Oligo dT序列的3’端存在幾個錨定堿基，如常見的miRNA加尾法逆轉錄引物。
2）隨機引物
隨機引物是若干個堿基組成的寡核苷酸，如隨機六聚體，5’-d（NNNNNN）-3’，是各種引物的混合物。它與模板結合的特異性低，可在整個轉錄本的多個位點退火，產生短的、部分長度的cDNA。常適用于獲取轉錄本5’末端序列及二級復雜結構的區域。一般不建議用于長片段序列的合成。有文獻報道15個堿基的隨機引物比6堿基和9堿基隨機引物轉錄出的cDNA產量和基因豐度更高[1]
3）基因特異性引物（GSP）
基因特異性引物（GSP）也即是反向引物，是與模板序列互補的引物，需要實驗者根據實驗需求自己設計合成，適用于目的序列已知的情況。若做一步法RT-PCR，只能用GSP引物。設計GSP的原則同PCR引物相同。
若研究真核基因時，可將Oligo dT與隨機引物混合使用，集二者之長，得到的cDNA均一性更好。實驗重復性也更高。
對三種引物有初步了解后，針對一些實驗中遇到的問題，小翊給大家提供了實驗建議。
實驗建議
問題一：大鼠肝臟的RT-qPCR，逆轉錄用的是oligo dT引物，PCR時內參出的很好，就是目的基因不出，已經差不多一個月了。怎么辦？
小翊建議：根據Oligo dT引物介紹，具有明顯二級結構的RNA也會破壞全長cDNA的合成，造成RNA 5’末端的代表性下降。同樣的，RNA模板出現降解時，也會造成Oligo dT全長cDNA合成能力的下降。建議使用Oligo dT/隨機引物的混合物作為逆轉錄啟動引物。
問題二：RNA模板有降解怎么辦？
小翊建議：盡量選用RNA質量好的樣本，但是如果條件不允許，建議用隨機引物，適合poly A比較短或被降解的情況做逆轉錄。
問題三：RNA病毒研究用什么引物？
小翊建議：在ＲＮＡ病毒的研究中一般用隨機引物和基因特異性引物。一方面是病毒RNA沒有ＰolyＡ的原因。另一方面，當復雜二級結構較多時，使用基因特異性引物有利于提高退火溫度，打開二級結構，合成較長的cDNA片段。
好啦,逆轉錄引物的介紹就到這里啦,期望對小伙伴的實驗有所幫助。
參考文獻
[1] Stangegaard M1, Dufva IH, Dufva M.Reverse transcription using random pentadecamer primers increases yield and quality of resulting cDNA[J].Biotechniques,2006 May,40(5):649-57.
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