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你是否正在驗證miRNA與lncRNA的作用機制？
是否在分析確認miRNA的靶基因？
在研究轉錄因子和啟動子的實驗中，你是否想確定結合位點的序列？
這些問題都可以用雙熒光素酶報告基因檢測系統來嘗試解決。
雙熒光素酶報告基因檢測系統介紹
基于熒光素酶（luciferase）的發光原理，科學家發明了雙熒光素酶報告基因檢測系統。該系統包括螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。兩者可催化各自的底物發生氧化作用產生生物熒光，產生的熒光數值大小即表示了兩種酶的表達量多少。
圖1. Luciferase發光原理
Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被稱為報告基因，是因為在基因表達調控研究時，利用兩者表達產生的熒光比值可以監控、證實微觀層面上的分子間的相互作用。具體做法是：將靶基因的轉錄調控元件或5’啟動子區克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR區或lncRNA結合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動子的強弱和轉錄因子對啟動子的作用或miRNA對目的基因或lncRNA的調控作用（見圖2）。與此同時，引入包含Renilla luciferase基因的TK載體作為內參，以便消除細胞轉染等因素帶來的組間誤差。
圖2.報告基因系統用于基因表達調控研究
雙熒光素酶報告基因檢測系統中的luciferase來源于細菌、螢火蟲、發光海洋生物等，可以在哺乳細胞中直接表達，無需表達后修飾，直接具備*酶活性。與綠色熒光蛋白（GFP）不同，它們的發光檢測不需要激發光激發，且發光穿透力更強，這使其具備可定量、高靈敏度及低背景等特點。
雙熒光素酶報告基因檢測的應用
下面從實驗方案設計、實驗數據處理及結果分析幾個方面介紹幾個案例，供大家參考。
1、利用雙報告基因檢測系統研究miRNA與3’UTR的相互作用
實驗目的：驗證大鼠miR-1與靶基因ATG13 3’UTR是否發生作用，并進一步確定miR-1與ATG13 3’UTR的作用位點。
實驗方案：構建luc-3’-UTR-WT載體和luc-3’-UTR-mut載體，將其與海腎載體及miRNA mimics共轉染293T細胞，轉染24-48h后使用雙熒光素酶報告基因檢測系統（翊圣產品貨號：11402ES）檢測。
實驗分組：
a | Luc-NC + mimics-NC |
b | Luc-NC + mimics-miR-1 |
c | Luc-3’UTR-WT + mimics-NC |
d | Luc-3’UTR-WT + mimics-miR-1 |
e | Luc-3’UTR-mut + mimics-NC |
f | Luc-3’UTR-mut + mimics-miR-1 |
實驗結果：
實驗分組 | Luc值（均值） | Ren值（均值） | Ratio (均值) |
Luc-NC + mimics-NC | 185214 | 32007 | 5.798 |
Luc-NC + mimics-miR-1 | 174577 | 30016 | 5.854 |
Luc-3’UTR-WT + mimics-NC | 186580 | 32249 | 5.820 |
Luc-3’UTR-WT + mimics-miR-1 | 35773 | 30233 | 1.202 |
Luc-3’UTR-mut + mimics-NC | 186556 | 32489 | 5.757 |
Luc-3’UTR-mut + mimics-miR-1 | 188393 | 32550 | 5.821 |
圖3. miR-1與3’UTR相互作用的分析（***表示p<0.001）
實驗結論：
ATG13 3’UTR為miR-1靶序列。
- 利用雙報告基因檢測系統研究轉錄因子與啟動子的相互作用
實驗目的：驗證轉錄因子IRF3對IFN-β啟動子的調控作用。
實驗方案：構建Luc-IFN-β啟動子載體和IRF3的過表達載體。共轉染后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統（翊圣產品貨號：11402ES）檢測分析熒光值差異。
實驗分組：對照組為Luc-IFN-β和pTK-RL，實驗組為Luc-IFN-β、pTK-RL和IRF3的過表達載體共轉染。
實驗結果：
實驗分組 | Luc值（均值） | Ren值（均值） | Ratio (均值) |
對照組 | 69576 | 456979 | 0.15 |
實驗組 | 462790 | 16248 | 28.48 |
圖4. IRF3對IFN-β啟動子的調控
實驗結論：轉錄因子IRF3對IFN-β啟動子起正調控作用。
影響雙熒光素酶報告基因檢測的因素
作為報告基因檢測試劑研發的廠家，我們為大家總結了獲取好數據的方法，避免大家掉坑：
坑1：檢測數值太低
正常表達水平下，熒光值的數量級應在104-107數量級左右，導致數值低主要有以下幾個原因：啟動子活性、轉染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不規范等原因，具體的原因需要實驗者進行排查。相應的解決方案如下表：
實驗問題 | 解決方案 |
轉染效率低 | 1、確保細胞狀態是良好的，通常選擇指數分裂期的細胞進行轉染； 2、可以選擇過表達的熒光蛋白質粒作為陽性對照； 3、轉染試劑的選擇也至關重要，比如在做miRNA研究的實驗中，如果Lipo2000或Lipo3000的轉染效率不能滿足的話，可以選擇更換其它轉染試劑。 |
裂解不充分
| 1、細胞培養時間不宜過長，不超過36h，培養時間過長的話，細胞難裂解 2、裂解液的量要足以充分裂解細胞 3、實驗對象為煙草葉片時，可在EP管中加入液氮和預冷的小鋼珠對葉片進行研磨，使裂解更充分 |
底物失效
| 1、底物保存的時候要避光低溫保存，尤其是腔腸素，推薦-80℃保存。 2、反應工作液建議現配現用。 |
操作不當 | 熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測，盡量在30min內完成。 |
坑2. 復孔差異大
雙報告基因檢測系統較為靈敏，檢測結果受多種因素的影響，因此，一般設置3個或3個以上的復孔，復孔之間有差異是正常的，差異在同一個數量級可以接受。想要得到更準確的實驗結果，需盡量減少復孔的差異性，建議如下：1、裂解后建議離心取上清，保證樣本均一性；2、保證加樣的準確性；3、樣品和底物混合后到檢測前的時間以及檢測時間應控制在相同的時間內。
以上的實驗方案和建議是否對您有幫助呢？如有不解歡迎咨詢小翊。祝大家實驗順利~
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