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溶酶體探針（LysoTracker & LysoSensor）
——酸性細胞器示蹤劑
背景介紹
溶酶體是一種分解蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的細胞器。溶酶體具單層膜囊狀結構，內含60余種酸性水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶等，分解各種外源和內源的大分子物質。溶酶體水解酶的適pH為3.5~5.5，溶酶體內的酸性環境是依靠膜上的特殊轉運蛋白(H泵)來維持的。溶酶體標志酶為酸性磷酸酶，目前針對溶酶體的定位也主要圍繞酸性磷酸酶展開。
圖1.溶酶體結構
溶酶體功能
溶酶體存在著形態上的多樣性和異質性，根據溶酶體處于完成其生理功能的不同階段， 大致分為以下幾種：
圖2.溶酶體分類及功能
溶酶體的主要功能是消化作用，主要通過三種途徑消化底物：1.自體吞噬細胞內原有的物質；2吞噬體吞噬有害物質；3.通過內吞作用提供的營養物質。吞噬作用也是細胞獲取營養的一種方式， 細胞通過內吞作用將一些營養物質包進內吞體，在溶酶體酶的作用下，將吞進的營養物質消化，用于合成代謝。
圖3.溶酶體吞噬作用
溶酶體疾病及檢測手段
溶酶體的酶發生變異，導致底物在溶酶體中大量堆積，影響細胞功能異常引起的疾病稱為溶酶體病。溶酶體與許多疾病的發生有著極為密切的關系，例如炎癥、矽肺、尤其是先天性溶酶體缺陷等疾病都與溶酶體機能異常有關。溶酶體異常還與休克、類風濕關節炎、腫瘤等疾病發生有關聯。
目前檢測溶酶體異常的手段有很多，包括光鏡鑒定法、電鏡鑒定法、.細胞學檢測法等等，這些方法可以直接檢測到溶酶體外形結構、通透性、pH變化等等。目前人類也開發了一系列溶酶體檢測試劑盒，包括細胞膜通透性（LAP）完成性吖啶橙染色試劑、LAMP抗體及二抗，還包括溶酶體探針類染料，LysoTracker探針和LysoSensor探針。LysoTracker探針和LysoSensor探針可以選擇性地標記和追蹤活細胞酸性細胞器。
Yeasen生物提供多款不同熒光基團標記的溶酶體探針如：綠色、紅色、黃色熒光基團等等，滿足您多標實驗的不同需求。
產品簡介
LysoTracker探針
LysoTracker探針，由熒光基團連接到一個弱堿性基團組成，其中僅弱堿基團可部分提供質子，以維持pH在中性值。這使LysoTracker探針可自由無阻地穿過細胞膜，特征性的聚集在球形細胞器，對酸性細胞器有高選擇性，用于活細胞溶酶體特異性熒光染色。機制尚不明確，可能涉及細胞器膜上的質子化和滯留，一般后面處理細胞的弱堿性滲透劑不會逆轉染色效果。LysoTracker熒光可能在整個細胞內熒光中占很小部分，因此很難通過流式或熒光計定量溶酶體數量。
LysoSensor探針
LysoSensor探針是細胞內的pH熒光指示劑，可通過質子化作用聚集在酸性細胞器內。這個質子化也減弱染料的熒光淬滅性，從而增加熒光強度。因此，與LysoTracker系列探針相比，LysoSensor系列探針隨著細胞器的酸化程度增強，其熒光強度呈極大的pH依賴型(向酸)增強。
產品選擇指南
注：探針標記細胞后，只能用熒光顯微鏡觀察，而不能用流式或熒光酶標儀檢測，因為在總細胞熒光中溶酶體熒光只占非常小的比例。
產品特點
特異性強：高選擇性地識別和標記靶向酸性細胞器，幾乎不對線粒體染色；
種類齊全：多種熒光顏色可供選擇、可與其他熒光染料或蛋白同時使用進行多色分析；
簡單方便：自由滲透細胞膜，一步法染色、標記活細胞細胞器--溶酶體，染料可快速導入；
靈敏度高：納摩爾濃度水平標記活細胞的效果較高。
染色結果
圖5A.4T1細胞染色結果圖。綠色是FITC標記細胞，紅色是LysoTracker Red DND-99 染色溶酶體。
參考文獻：Di L, Yang A , Simin F , et al. Imidazole-Bearing Polymeric Micelles for Enhanced Cellular Uptake, Rapid Endosomal Escape, and On-demand Cargo Release[J]. AAPS PharmSciTech, 2018. 19(6), 2610–2619.
圖5B. Hela細胞染色結果圖。(a) Lyso-Tracker Red DND-99染色Hela細胞；(b) Lysosensor Green DND-189染色Hela細胞
參考文獻：Zhang L, Chen X,, et al. Palladium nanoparticles induce autophagy and autophagic flux blockade in Hela cells. RSC Advances, 2018,8(8), 4130–4141.
FAQ
問題類別 | 問 | 答 |
實驗 咨詢 | 1.四種溶酶體探針的區別？ | LysoTracker®--不依賴pH的活細胞溶酶體熒光探針（貨號40738和40739）； LysoSensor™--依賴pH的活細胞溶酶體熒光探針（貨號40767和40768）。 |
2.LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO探針原理？ | LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO)是一種pH依賴型顯示雙激發和雙發射波長的熒光探針：
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3.染色時，細胞的狀態？ | 這四種探針是對活細胞中的酸性區室進行染色。所以必須要在活細胞狀態下染色。 | |
4.染色完成后，細胞是否能固定后再檢測熒光信號？ | 固定后會破壞溶酶體的酸性環境從而會造成熒光減弱甚至消失的情況，染色前后均不建議固定。 | |
5.可以和二抗一起孵育嗎？ | 不可以，孵育二抗必須要透化處理，而透化會破壞溶酶體的酸性環境，影響染色效果。 | |
6.這個探針可以染自噬溶酶體嗎 | 自噬溶酶體和正常的溶酶體在形態結構上有較大差異，該探針主要是針對常規的溶酶體染色，對于自噬溶酶體的染色效果不是很確定，可以參考一些使用過該產品發表的文獻資料確定。 | |
7.植物細胞和組織適用嗎？ | 理論上可以，一般植物細胞或者組織要制成原生質體。 | |
8.可以染色其他酸性細胞器嗎？ | 可以染色其他酸性細胞器，建議極低濃度下才能優先選擇染色酸性溶酶體。 | |
9.染色后可以放置一夜，再熒光檢測嗎？ | 建議染色完立即檢測熒光，時間過長，熒光信號會逐漸減弱。 | |
10.用細胞培養基配成工作液以后穩定嗎？可以存放多久？ | 工作液是需要現配現用的，不建議保存。 | |
11.檢測儀器？ | 熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、酶標儀、流式細胞儀。 | |
12.如何做到同時染色溶酶體和細胞核的？ | 建議用Hoechst 33258/ Hoechst 33342染色細胞核，這個染料可以直接染活細胞不需要固定操作。 | |
13.保質期多久？ | -20℃避光保存，半年有效。 | |
實驗 問題 | 14.熒光信號較弱？ | 大致有3個原因： 1.溶酶體探針濃度過低，建議適當增大濃度； 2.染色時間過短，建議延長染色時間； 3.染色完之后，放置過長時間才檢測信號；建議染色完立刻檢測。 |
15．沒有熒光信號？ | 大致有3個原因： 1.先用多聚甲醛、乙醛等固定細胞，破壞了溶酶體的酸性環境。 2.染色完后，又用多聚甲醛固定細胞，或者透化細胞，破壞了溶酶體的酸性環境；染色前后均不建議固定細胞； 3.染色完到上機檢測這一段時間過長，并且沒有避光處理。建議避光染色，染色完立即檢測熒光信號。 | |
16.在活細胞狀態下，用50 µM探針染色50 min，然后發現除了溶酶體，細胞質中也有熒光信號，這主要是什么原因導致？ | 大致有一下3個原因： |
相關產品
產品 | 貨號 | 規格 | 價格（¥） |
LysoTracker Green DND-26 溶酶體綠色熒光探針 | 40738ES50 | 50μL | 425.00 |
LysoTracker Red DND-99 溶酶體紅色熒光探針 | 40739ES50 | 50μL | 425.00 |
LysoSensor™ Green DND-189 溶酶體綠色熒光探針 | 40767ES50 | 300T | 1533.00 |
LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO) 溶酶體黃/藍色熒光探針 | 40768ES50 | 50μL | 425.00 |
