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關于新冠病毒RT-PCR核酸檢測假陰性結果的思考
在新冠肺炎防治工作開展過程中，隨著對發病機制、臨床表現、臨床體征、診斷技術等方面認識逐步清晰，病人的診治方案也逐步完善。近期，非常多的討論集中在新冠病毒核酸檢測方法出現漏檢和假陰性的問題上面。
1. 在全國其他省份新增確診人數連續下降的背景下，自2月12日起連續兩天的湖北省衛健委發布的通報中，分別提到“當日新增臨床診斷病例4890例，現有臨床診斷病例10567例”和“新增新冠肺炎病例14840例(含臨床診斷病例13332例)”。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》在湖北省的病例診斷分類中增加了“臨床診斷”。根據該方案，湖北省將臨床診斷病例數納入確診病例數進行公布。臨床診斷病例指具有肺炎影像學特征的疑似病例，但確診病例診斷標準不變。
2. 1月12日，李文亮醫生因發燒、咳嗽在武漢中心醫院接受隔離治療。2月1日，他發布微博“今天核酸檢測結果陽性，塵埃落定，終于確診了”。回顧李文亮英雄病情確診進展：共查了3次核酸檢測，第—次結果未知，第二次陰性，第三次陽性，用了20天。2月6號，南方周末報道杭州一所醫院病例測了6次核酸試劑都為陰性，直到第7次才測出陽性。
3. 重慶市人民醫院三院院區檢驗科對6種國產新型冠狀病毒核酸檢測試劑檢測性能進行了比較與分析，得出結論對弱陽性樣品的檢測能力有差異，部分試劑的準確性、靈敏度及重復性欠佳，亟需進一步優化，提高其性能，以便更好地適應大規模的篩查需求。對診斷試劑性能及其穩定性提出疑問。
4. 2月5日，危重癥醫學專家、中國醫學科學院院長王辰院士接受央視采訪時表示，“對于真是這個病的病人，也不過只有30%-50%的陽性率。通過（采集疑似病患）咽拭子的辦法，還是有很多假陰性的。核酸沒有發現，但是實際上是的。”
一、為何選擇核酸檢測作為確診感染的金標準呢？
核酸作為生物的遺傳物質，由A、T、C、G四種堿基按照不同的順序排列組成。堿基排列順序的相似性決定了物種之間的保守性，具有相似性的堿基序列為物種間的保守序列。堿基排列順序的不同決定了物種之間的特異性，這些特異性的區域有別于其他物種，具有物種的代表性。新型冠狀病毒的遺傳物質是RNA，由3.3萬個左右的堿基組成。實時熒光RT-PCR是通過引物和探針與新冠病毒核酸特異性的RNA區域高度匹配，一旦檢測到，即可判斷為“陽性”；高通量測序技術是對新冠狀病毒核酸序列進行完整測序并全序列比對分析，與已知新型冠狀病毒高度相似的，即可判斷為“陽性”。因此，從方法學上來看，核酸檢測技術是直接本質的病原學證據，優于其他臨床表現、臨床體征及CT檢測等經驗判讀。這就是我們說病毒核酸檢測是確診感染的“金標準”。相較于高通量測序技術，RT-PCR診斷耗時短，檢測樣本多，結果判定簡單快速，檢測成本低，特別適合本次大面積流行的新冠肺炎疫情。
圖1. 新型冠狀病毒與SARS冠狀病毒ORF1b-nsp14相似性與特異性：·代表相同堿基。
二、假陰性概念及造成假陰性的原因
上面新冠病毒核酸檢測方法出現漏檢和假陰性的報道不再是關注出結果的速度，更側重于核酸檢測結果的準確性。所謂漏檢和假陰性指的是一個新冠肺炎患者應該被確診為陽性，但RT-PCR未檢測到新型冠狀病毒RNA。漏檢和假陰性會帶來的社會恐慌及對病情醫治的控制不及時的影響可想而知。
由上面圖片可以看出，產生假陰性的原因，可能包括：
1. 方法學：因bing毒變異，引物和探針不能識別變異后的序列。
2. 樣本采集與保存環節：采樣部位不含病毒或病毒含量較低，不能真實反映疾病情況。這涉及到對病毒的致病機理及疾病進程的認識。樣品保存不當，造成病毒核酸降解。
3. 核酸提取環節：提取核酸質量差，或提取效率低，病毒核酸有損失。
4. 基因擴增環節：試劑檢測下限不夠，或試劑性能穩定性欠佳；或儀器設備的準確性和穩定性。
5. 人為因素：實驗操作不當。
一句話概括，要避免假陰性的產生，需要全行業全流程的專業質控標準和體系建設來保證RT-PCR檢測的穩定性。
三、如何應對假陰性
從規避RT-PCR假陰性問題上，我們需要：
A. 制備達到一定數量的病毒RNA
要求采樣部位含有病毒并且病毒含量要達到檢測的試劑下限。病毒含量在病程早晚期階段以及機體不同部位有所不同（這與病毒入侵機制有關），剛感染機體時，病毒在機體內復制少，整體含量均低。在應對未知疫情時，對于感染機制、病癥等缺乏了解時，取樣部位的選擇更加受限。目前了解到，新冠病毒檢出的取樣部位的難易程度為肺泡灌洗液，深咳痰，鼻咽部，口咽部，血液，糞便。通過對疑似病人多個部位同時采樣或同一部位反復檢測來增加采集到病毒RNA的幾率。
樣本中病毒RNA需經過提取，以實現病毒的有效富集及純化。提取要求可以短期內充分裂解釋放樣本中的核酸，并大限度的回收高純度病毒核酸。RNA易被環境中（操作環境及操作人）或醫療樣本內源性的RNase降解，提取過程中要特別注意。推崇自動化操作，減少人為因素帶來的偏差。
B. 與病毒RNA匹配的引物與探針
病毒傳染人群的目的在于存活，在流行一段時間后會發生變異，以保證它的傳染性。病毒的變異表現是在它核酸序列突變后，即堿基序列發生變化。用于RT-PCR病毒核酸檢測的引物與探針是否會適用于變異后的病毒這是個變量。目前，新型冠狀病毒的變異能力R0為3.77人。因此，針對病毒核酸多個區域設計匹配引物和探針很重要，監控病毒一代傳染，二代傳染人群數量，實時引入高通量測序手段對病毒核酸進行分析也很重要。
另外，據圈內從事Oligo合成的大佬所說，引物與探針的質量對于RT-PCR表現也至關重要。
C. 高效擴增病毒RNA
相較于CT影像學、臨床體征等臨床表現，在保證前端取樣、核酸提取情況下，RT-PCR更靈敏。它實現了病毒分子體外一變二，二變四成指數倍的積累放大，可以幫助疾病的早發現，早治療。目前新冠qPCR檢測試劑盒的低檢出限一般是200-1000 cp/mL。另一個要考慮的是檢測試劑盒低檢出限的穩定性。上游酶原料和輔料的生產工藝對于qPCR檢測下限和穩定性至關重要。
后，針對疾病的診斷不應只依靠于分子檢測，應結合RT-PCR檢測結果、病人的癥狀等綜合診斷疾病。不過，建議在資源允許，即使是散發性的疑似病例也需經病原學技術確診。
就RT-PCR作為分子診斷手段的假陰性問題，我們還應更細致地結合本次疫情深入思考：如何更精準地保證樣品采集與保存、核酸分離純化及核酸擴增等各環節的穩定性與精準性。
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