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技術文章

技術探討-細菌中提取分泌蛋白質的方法

閱讀:3135          發布時間:2013-7-22
上海滬鼎生物根據售后處理客戶問題解答;結合技術部的實驗探討,特別針對細菌中提取分泌蛋白質有哪些方法做出解釋,本次實驗僅供參考依據,具體以實驗標準為準。
客戶需要從細菌中提取一種可分泌至培養基上清的一種小分子多肽,按照文獻的方法是取細菌上清后用氯仿抽提,可反復做過多次,蛋白總是沒有活性,不知道各位同仁有沒有什么好方法?請指教!
以下參考意見:
參考一:
氯仿是有機溶劑,所以但沒有活性。分離這種分泌性蛋白質,可以先將上清液透析,然后過柱。

參考二:
蛋白要保持活性,必須維持三維構象,而在有機溶劑處理的情況下,蛋白的三維構象被破壞,自然就沒有活性了。
如果你的培養液是高鹽濃度的,你可以在得到上清的可溶性蛋白后,加入5-10倍體積的復性液,以稀釋鹽濃度,防止在下一步透析過程中隨著鹽濃度的降低,造成蛋白析出沉淀而喪失活性,然后用透析袋進行透析,4度以防止蛋白降解,4-6小時,然后冷凍干燥,這樣得到的蛋白就能保持活性了。

參考三:
你的蛋白鏈內有二硫鍵么?結構一般不會太復雜吧?除非有復雜的二硫鍵,這么小的蛋白,復性應該不是主要矛盾。
一些小蛋白如果在有機溶劑中發生的疏水結構的改變是可逆的,而且疏水性較強,那可能就可以用氯仿抽提,很容易和大部分蛋白分開,不過脂類和脂蛋白肯定去不掉。
但是能溶于氯仿,你的蛋白我懷疑很有可能一般的水相條件并不是很好溶,先確定一下這個問題,然后結合你的測活方法,看看是不是在測活的時候蛋白失活的。

參考四:
我的蛋白確實是在一般的水相條件不好溶,活性的檢測方法沒什么問題,
氯仿抽提后用6M的尿素溶解,加ddH2O 倍比稀釋后檢測活性! 這是文獻上的方法,可總是沒有活性。 不知道是不是氯仿抽提的方法有問題? 氯仿抽提法有沒有什么要注意的地方?

參考五:
培養上清中沒有尿素,可能蛋白濃度不高,但還是要確定一下蛋白能溶么?
或是直接純化前取上清測活看看,到底是不是氯仿的問題。

參考六:
我所提的蛋白是不溶于水的,但是在6M、8M的尿素中是可容的
取上清做證實上清是有活性的,所以我覺得是尿素沒有將我所需求的蛋白抽提出來,不知道是不是細節上出了些問題?各位,有沒有更好的辦法呢?

參考七:
是氯仿沒有把我所需的蛋白抽提出來

 

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