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小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中C肽實驗心得
閱讀：1547 發(fā)布時間：2013-6-20小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中C肽實驗心得
實驗心得一：實驗步驟
1. 準備：從冰箱取出試劑盒，室溫復溫平衡30分鐘。
2. 配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3. 加標準品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標包被板，固定于框架上，分別設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標準品孔中加入標準品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對照孔不加。
4. 溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
5. 洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。
6. 加酶標工作液：每孔加入酶標工作液50μL，空白對照孔不加。
7. 溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
8. 洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，平板混勻器混勻30s（或用手輕輕震蕩混勻30s），37℃避光顯色15min。
10. 終止：取出酶標板，每孔加終止液50μL，終止反應（顏色由藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。
12. 計算：根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品濃度，也可以使用各種應用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。
實驗心得二：注意事項
1. 樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因為疊氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。
2. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能立即試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
3. 樣本應充分離心，不得有溶血及顆粒。
4. 實驗嚴格按照說明書的操作進行，實驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。
5. 酶標包被板開封后如未用完，應立即裝入密封袋中加干燥劑保存。
6. 建議所有的標準品、樣本和空白對照都做雙份檢測，取平均值，以減小實驗誤差。
7. 牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍，計算結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。
8. 本試劑盒定量范圍為62.5-2000pg/mL，超過此范圍，為標準曲線延伸計算所得，不做為準確定量結(jié)果，請用特殊稀釋液稀釋后測定準確結(jié)果（62.5-2000pg/mL范圍內(nèi)），乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本zui終濃度。
9. 若顯色過淺，可適當延長底物溫育時間。
10. 為避免交叉污染，標準品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭；酶標工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復使用封板膜。
11. 試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號的試劑不得混用。
12. 底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。
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