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技術(shù)文章

小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中C肽實驗心得

閱讀:1547          發(fā)布時間:2013-6-20

小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中C肽實驗心得

實驗心得一:實驗步驟

 

1. 準備:從冰箱取出試劑盒,室溫復溫平衡30分鐘。

2. 配液:用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

3. 加標準品和待測樣本:取足夠數(shù)量的酶標包被板,固定于框架上,分別設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔,記錄各孔位置,在標準品孔中加入標準品50μL;待測樣本孔中先加入待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL(即樣本稀釋5倍);空白對照孔不加。

4. 溫育:37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

5. 洗板:棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板4次(也可用洗板機按說明書操作洗板)。

6. 加酶標工作液:每孔加入酶標工作液50μL,空白對照孔不加。

7. 溫育:37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

8. 洗板:棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板4次(也可用洗板機按說明書操作洗板)。

9. 顯色:每孔先加入顯色劑A 液50μL,再加入顯色劑B液 50μL,平板混勻器混勻30s(或用手輕輕震蕩混勻30s),37℃避光顯色15min。

10. 終止:取出酶標板,每孔加終止液50μL,終止反應(顏色由藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

11. 測定:以空白孔調(diào)零,在終止后15分鐘內(nèi),用450nm波長測量各孔的吸光值(OD值)。

12. 計算:根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值,計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣本的OD值,在回歸方程上計算出對應的樣品濃度,也可以使用各種應用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。

 

實驗心得二:注意事項

 

1. 樣本不能含疊氮鈉(NaN3),因為疊氮鈉(NaN3)是辣根過氧化物酶(HRP)的抑制劑。

2. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能立即試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融。

3. 樣本應充分離心,不得有溶血及顆粒。

4. 實驗嚴格按照說明書的操作進行,實驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。

5. 酶標包被板開封后如未用完,應立即裝入密封袋中加干燥劑保存。

6. 建議所有的標準品、樣本和空白對照都做雙份檢測,取平均值,以減小實驗誤差。

7. 牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍,計算結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。

8. 本試劑盒定量范圍為62.5-2000pg/mL,超過此范圍,為標準曲線延伸計算所得,不做為準確定量結(jié)果,請用特殊稀釋液稀釋后測定準確結(jié)果(62.5-2000pg/mL范圍內(nèi)),乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本zui終濃度。

9. 若顯色過淺,可適當延長底物溫育時間。

10. 為避免交叉污染,標準品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭;酶標工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分,要懸臂加樣,不得碰到微孔;不得重復使用封板膜。

11. 試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用,不同批號的試劑不得混用。

12. 底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。

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