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技術(shù)文章

ELISA實驗之細胞樣本的處理方法

閱讀:1070          發(fā)布時間:2023-8-18

ELISA(酶聯(lián)免疫吸附劑測定)是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確可靠的一種定量分析方法,樣本的處理對于ELISA實驗的成功有著舉足輕重的作用。 利用ELISA進行檢測的樣本類型包括常見的血液(血清、血漿),組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清以及不常見的皮膚組織、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、精液、陰道分泌物等,這些樣本收集的時間、處理方法和保存都會影響到ELISA實驗的結(jié)果。下面就常見ELISA細胞處理方法的整理,希望對您有所幫助。

 

 

細胞樣本根據(jù)目的物所在部位可選擇細胞裂解液或細胞培養(yǎng)上清作為樣本。 需要注意的是: 因該類樣本干擾因素較多, 如細胞狀態(tài)、 細胞數(shù)量(大于 10^6)、ph(約為 7)、培養(yǎng)基鹽離子濃度、采樣時間等,所以可能存在檢測不出的情況。

 

 

如果目的物是分泌型,主要在胞外,即可選擇細胞培養(yǎng)上清作為樣本,如果目的物主要存在于胞內(nèi),則建議選擇細胞裂解液作為樣本類型。細胞培養(yǎng)上清處理方法相對簡單,取細胞培養(yǎng)上清,1000×g 離心 20 分鐘,取上清即可檢測。

 

 

細胞裂解液:

 

1)貼壁細胞需要先用胰酶消化,離心收集細胞(懸浮細胞可直接離心收集) ;

 

2)將收集到的細胞用冷PBS 3次;

 

3)物理方法裂解細胞(可先超聲破碎細胞,再反復(fù)凍融) :

 

       ? 超聲破碎:取適量PBS 重懸細胞,用一定功率的超聲波處理細胞懸液,使細胞急劇震蕩破裂;

 

       ? 反復(fù)凍融:將待破碎的細胞在-20 度以下冰凍,室溫融解,反復(fù)3次,使細胞溶脹破碎;

 

4)將標(biāo)本于2-8 1500×g 離心 10 分鐘,收集上清備用。

 

 

一般情況下,物理方法如反復(fù)凍融,勻漿等方法會比化學(xué)方法好,因為化學(xué)方法會引入酸或堿,可能會對ELISA實驗產(chǎn)生影響。我們也做了相關(guān)實驗來評測化學(xué)提取液和洗滌劑對ELISA檢測的影響,如 RIPA、TritonX-100NP-40SDS、脫氧膽酸鈉、β巰基乙醇、DTT 和尿素。根據(jù)我們的質(zhì)檢結(jié)果,高濃度的洗滌劑會影響ELISA檢測的終結(jié)果。然而,其效果會洗滌劑濃度的降低而減少。與其他化學(xué)裂解緩沖液相比,1%的 Triton X-100 1NP-40 ELISA檢測的影響較小。如果一定要用化學(xué)提取方法的話,推薦用這兩種洗滌劑來提取靶蛋白。利用化學(xué)的細胞裂解液裂解細胞,如果去污劑成分會干擾抗原抗體反應(yīng)影響檢測效果,推薦利用透析和超濾的方法除去去污劑成分。

 

 

處理樣本的過程就是收集目標(biāo)蛋白的過程,由于蛋白容易變性,降解,故該過程應(yīng)盡量溫和。樣本處理之后的儲存也非常重要,尤其注意不要反復(fù)凍融,樣本處理之后可分裝密封保存, 4 度保存應(yīng)小于 1 周,-20 度不應(yīng)超過 1 個月,-80度不應(yīng)超過2個月。在標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫,不應(yīng)加熱使之融解。樣本的處理是實驗成功的第yi, ,以上就是關(guān)于常見樣本處理方法的一個簡述,供研究者參考。


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