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技術文章

引物是怎么樣合成的?

閱讀:2980          發布時間:2020-7-8

    目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產,而Bioneer自行研制的384并行高通量DNA合成儀,可實現99%的高合成率。無論采用什么機器合成,合成的原理都相同,主要差別在于合成產率的高低,試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。

    亞磷酰胺三酯法合成DNA段,具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。

    第fist步是將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三lu乙酸反應,脫去其5′-羥基的保護基團DMT,獲得游離的5′-羥基。

    第二步,合成DNA的原料,亞磷酰胺保護核苷酸單體,與活化劑四氮唑混合,得到核苷亞磷酸活化中間體,它的3′端被活化,5′-羥基仍然被DMT保護,與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應。

    第三步,帶帽(capping)反應,縮合反應中可能有極少數5′-羥基沒有參加反應(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應,這種短片段可以在純化時分離掉。

    第四步,在氧化劑碘的作用下,亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。

    經過以上四個步驟,一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三lu乙酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT,重復以上步驟,直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。通過氨水高溫處理,連接在CPG上的引物被切下來,通過OPC, PAGE等手段純化引物,成品引物用C18濃縮、脫鹽,沉淀。沉淀后的引物用水懸浮,測定OD260定量,根據定單要求分裝。

    上海滬鼎是一家研究經銷生化試劑的專業代理商,我司擁有一支雄厚的技術團隊,為客戶提供完善的售前售后服務,及真實的實驗技術支持。您有任何問題均可咨詢訂購我司試劑盒,生物試劑等產品。

       

              

 

 

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