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蛋白質的免疫染色法檢測分析方法

閱讀:1588          發布時間:2020-3-3

    蛋白質的免疫染色法檢測分析

    轉印到紙上的蛋白質抗原,可與其專一性抗體結合,再以二次抗體-酶結合體(2nd Ab-HRP) 或Protein A-HRP 呈色;可在一群轉印色帶中,專一性地挑出目標蛋白質,是zui有用的檢定工具 (Burnett,1981)。

    藥品試劑:

    抗體溶液:可用傳統抗血清或單株抗體,其zui適使用濃度,隨抗體效價不同而異,以下為一般適用范圍的參考,均以明膠-NET 稀釋的。

    a. 傳統抗血清: 1:100 到1:1,000

    b. IgG (冷凍干燥品): 10~50 μg/mL

    c. 單株抗體 (小白鼠腹水) : 1:200到1:5,000

    d. 單株抗體 (細胞培養液): 原液或1:10明膠-NET:用來稀釋抗體溶液或酶聯體明膠gelatin (Merck 4070, 0.25%) 5.0 gm;NaCl (0.15 M) 17.5 gm;EDTA (5 mM) 3.6 gm;Tween-20 (0.05%) 1.0 mL;Tris (Tris base, 50 mM) 12.1 gm加熱溶解于1,800 mL 純水后pH 調到8.0,再加水到 2,000 mL

    酶聯體:可使用2nd Ab-HRP 或Protein A-HRP,使用濃度每家商品不同,約為1:1,000到1:5,000 的間,以明膠-NET 稀釋的。

    PBST 洗液DAB 基質溶液:DAB (diaminobenzidine, Sigma D-5637) 5 mg溶于100 mL Buffer A-0,再加10 μL H2O2,新鮮配制,避光貯存。 DAB 為致癌物質,稱量時勿吸入DAB 細塵,并小心處理秤量紙。

    方法步驟:

    1) 尿素洗過夜的轉印紙再以10 mL PBST 洗三次,每次約10 min,均在上述方形培養皿中進行。

    2) 轉印紙放在明膠NET 溶液中反應,置室溫中反應1 h。一般使用方形培養皿當容器,但亦可裝入塑料袋中反應,較節省試劑用量。

    3) 反應后,以PBST 浸洗二次。

    4) 把轉印紙放在抗體溶液中反應,置室溫反應1 h。

    5) 反應后以PBST 洗三次,改用酶聯體反應,在室溫下反應1 h。

    6) 以PBST 洗四至五次,注意容器也要洗干凈。

    7) 加入DAB 基質溶液約10 mL 呈色,盡量避光,并且不時搖動呈色液。

    8) 數分鐘內可呈色,在背景加深前倒去DAB,以水沖過數次后晾干。

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