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實驗方法原理	大多MDR細(xì)胞膜上出現(xiàn)MDR-1基因及其基因產(chǎn)物P-糖蛋白過度表達(dá)。
實驗材料	RNA
試劑、試劑盒	PBS 氯仿異丙醇萘酸異硫氰酸肽十二烷基肌酸鈉構(gòu)櫞酸鈉乙酸鈉二疏基乙醇乙醇 Taq酶
儀器、耗材	離心機紫外分光光度計瓊脂糖凝膠電泳 PCR儀
實驗步驟	一、細(xì)胞總RNA提取 1. 收集約5×10⁷個細(xì)胞，冷PBS洗滌。 2. 加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的異硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸鈉，0.025 mol/l 構(gòu)櫞酸鈉pH7.0，0.25 mol/l 乙酸鈉，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混勻。 3. 加入400 ul 氯仿，混勻，以13 000 r/min 于4℃離心15 min。 4. 取上清液加入等體積的異丙醇，4℃放置30 min。 5. 然后以13 000 r/min 離心15 min，吸上清，將RNA成點用75%的乙醇洗滌1次，溶于100 ul 的無菌雙蒸餾水中。 6. 并用紫外分光光度計檢測RNA純度（A₂₆₀/A₂₈₀應(yīng)為1.8~2.0）后備用。二、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增 1. 引物 2. 取細(xì)胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系中，42℃保溫30 min 進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。 3. 然后置95℃，3 min 終止反轉(zhuǎn)錄。 4. 接著在Taq酶的作用下，用mdr-1和β₂-MG引物，對cDNA上的目的片段進行PCR 5. 94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴增35個循環(huán)。 6. zui終在60℃保溫7 min，以保證產(chǎn)物充分延伸。 7. 取10 ul 擴增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下照相，與mdr-1 cDNA陽性對照，等位的DNA條帶為陽性，反之為陰性。

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DNA實驗技術(shù)：多藥抗藥基因的表達(dá)實驗

多藥抗藥基因的表達(dá)實驗

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