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上海北諾生物科技有限公司
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1．目的
學(xué)會(huì)用酶切法或PCR法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌。
2．原理
利用轉(zhuǎn)化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。
3．器材
旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。
4．試劑
LB培養(yǎng)基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試劑，酶切需要的限制性內(nèi)且酶及其緩沖液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris-Cl pH8.0）。
5．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
無菌dd water，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）；牙簽（滅菌），搖菌管（滅菌），100mg/mL氨芐青霉素。
6．操作步驟
方法一：酶切鑒定
（1）在超凈工作臺(tái)中取3支無菌搖菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素），用記號(hào)筆寫好編號(hào)。
（2）在超凈工作臺(tái)中將70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過，鑷取一支無菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上的一個(gè)白色菌落，然后將牙簽放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素）的搖菌管中。用此法隨機(jī)取3個(gè)白色菌落，分別裝入3個(gè)搖菌管中。
（3）37℃搖菌過后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒。搖菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。
（4）將提取到的3管質(zhì)粒樣品與空質(zhì)粒同時(shí)電泳，根據(jù)分子量判斷和選區(qū)有插入片段的質(zhì)粒，然后可用酶切、與目的片段一同電泳來鑒定其上的外源插入片斷大小是否與預(yù)期相符。
（5）將經(jīng)過鑒定判斷為正確的質(zhì)粒保存。按照編號(hào)找到冰箱中原菌液。根據(jù)需要進(jìn)行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒或進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，或取500mL菌液與500mL 65%甘油混合后-80℃保存。
（6）在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。
方法二：快速PCR篩選法
（1）在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取3個(gè)邊緣清晰的白色菌落，并用記號(hào)筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標(biāo)記編號(hào)。
（2）在0.2ml PCR 微量離心管中配制25μl反應(yīng)體系。
dd water 16μl
10×PCR buffer（不含MgCl2） 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl（每種dNTP終濃度0.2mM）
10μmol/L Primer1 1μl（12.5-25pmoles）
10μmol/L primer2 1μl（12.5-25pmoles）
Taq酶 0.5μl（1.5u）
總體積 25μl
模板質(zhì)粒： 用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗
（2）根據(jù)廠商的操作手冊設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序（本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)設(shè)置為WZ）：
① 94℃ 5min
② 94℃ 1min
③ 60℃ 1min
④ 72℃ 1min50s
⑤ goto② 29 times
⑥ 72℃ 10min
（2）PCR結(jié)束后，取10μl產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時(shí)比對）。觀察膠上是否有預(yù)計(jì)的主要產(chǎn)物帶。
（3）按照編號(hào)找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。根據(jù)需要進(jìn)行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒
（4）提取到的質(zhì)粒與原先的空載體（或已知分子量的質(zhì)粒）再對比電泳，用酶切以進(jìn)一步確認(rèn)。
