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DNA實驗技術:植物組織制備基因組DNA實驗

2013-8-22  閱讀(983)

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標簽: 植物組織 基因 DNA

利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細胞器或質粒等小分子DNA分離。在提取過程中,染色體會發生機械斷裂,產生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時應盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。

實驗方法
  • 氯化銫法
  • CTAB法
實驗方法原理 加入一定量的異丙醇或乙醇,基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團飄浮其中, 可用玻棒將其取出,而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部, 從而達到提取的目的。
實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
1.  收取10~50 g 新鮮的植物組織。
 
2.  植物組織用冷的無菌水洗滌、吸干,放人液氮中凍結,用研缽和研杵研成細粉。

3.  將凍結的細粉放入250 ml 的離心瓶中,立即加入抽提緩沖液約每克植物5~10 ml,輕輕攪拌混勻。

4.  加入十二烷基肌氨酸鈉使終濃度達1%,于溫育1~2 h。
 
5.  用JA-14轉子4℃,5 500 g 離心10min 保留上清,必要時重復此歩驟以除去殘渣。

6.  加人0.6體積異丙醇,混合,如果看不見沉淀,于-20℃放置30 min,用JA-14轉子4℃,7 500 g 離心15 min,棄上清。

7.  沉淀用9 ml TE緩沖液重懸,加入9.7 g 固體氯化銫,混勻,冰上放置30 min,用JA-14轉子,7 500 g 離心10 min,保留上清。
 
8.  加入0.5 ml 10 mg/ml 的溴化乙錠,冰上放置30 min,4℃ 7500 g  離心10min.

9.  將上清轉入兩個5 ml 的快封超離心管中,并封口。

10.  用VTi80轉子20℃ 525 000 g 離心4 h,或20℃,300 000 g 離心,用15號針頭和注射器收集帶。

11.  用氯化艷飽和的異丙醇重復抽提DNA以除去溴化乙錠。
 
12.  加入2體積水和6體積100%乙醇,混勻,-20℃放置1 h,用JA-20或JA-21轉子4℃,7500 g 離心10 min。
 
13.  沉淀用TE緩沖液重懸,加入1/10體積的3 mol/l 乙酸鈉和2體積的100%乙酵重懸,重復離心。

14.  沉淀晾干后用TE緩沖液重懸

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